組蛋白修飾變化參與曲古抑菌素A緩解的煙草煙霧暴露所致小鼠子宮損傷過程

婁 毅 ,叢艷飛 ,丁晶晶 ,李 芳 ,王莉莉

(1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)教研室，遼寧 沈陽(yáng) 110122;2.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院實(shí)驗(yàn)研究中心，遼寧 本溪 117000)

中國(guó)是世界上最大的煙草生產(chǎn)和消費(fèi)國(guó)，2002 年中國(guó)女性居民主動(dòng)吸煙率為3.1%，被動(dòng)吸煙率高達(dá)54.6%[1]。煙草煙霧(cigarette smoke，CS)中含有多環(huán)芳香烴(PAHs)、苯并芘(BaP)、尼古丁、生物堿和重金屬等 4 000 多種有害化學(xué)物質(zhì)[2]。研究發(fā)現(xiàn)，吸煙會(huì)使處于育齡期的女性生育力下降[3]，口服尼古丁會(huì)導(dǎo)致大鼠子宮腔上皮和腺上皮形態(tài)學(xué)改變[4]，CS 暴露可導(dǎo)致子宮 MMP-9、CXCR4和ER的表達(dá)增加[5]。我們前期的研究表明，CS暴露通過激活組蛋白脫乙酰基酶1/2(histone deacetylase，HDAC)，導(dǎo)致小鼠子宮肌層和子宮內(nèi)膜變薄，腺體組織和間質(zhì)細(xì)胞明顯減少等組織形態(tài)學(xué)改變，TSA，HDAC的通用抑制劑，通過抑制 HDAC 1/2 和 mTOR 的激活，重新激活自噬，改善CS暴露引起的小鼠子宮組織形態(tài)學(xué)改變[6]。此外，我們還發(fā)現(xiàn) P2RX7介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡和凋亡參與了 TSA 緩解的CS 暴露所致的小鼠子宮損傷過程[7]。因此，進(jìn)一步探究煙草煙霧暴露對(duì)女性生育能力影響的相關(guān)分子機(jī)制將為提高女性生育健康做出一定貢獻(xiàn)。

環(huán)境毒素可以通過表觀遺傳學(xué)機(jī)制影響基因表達(dá)水平，進(jìn)而影響個(gè)體的表型或者疾病的易感性[8]。表觀遺傳學(xué)修飾包括翻譯后的組蛋白修飾，如組蛋白的乙酰化和甲基化修飾、DNA的甲基化修飾等，表觀遺傳修飾在轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[9-10]。組蛋白修飾水平變化和相關(guān)組蛋白修飾轉(zhuǎn)移酶的變化和很多子宮疾病有關(guān)[11-14]。在子宮內(nèi)膜異位癥的異位內(nèi)膜組織中發(fā)現(xiàn)全組蛋白 H3K4 和 H3K9 的低甲基化，說明組蛋白修飾異常在子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病中發(fā)揮重要作用[11]。子宮內(nèi)膜異位癥患者的異位子宮內(nèi)膜中 H3K27me3 陽(yáng)性細(xì)胞百分比明顯低于正常分泌型子宮內(nèi)膜。此外，H3K27me3 的甲基轉(zhuǎn)移酶 EZH2 在子宮內(nèi)膜異位癥上皮細(xì)胞中高水平表達(dá)。提示 H3K27me3 在子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病中的作用和 EZH2 可能作為該疾病的潛在治療靶點(diǎn)[12]。以上結(jié)果表明，組蛋白修飾和相關(guān)轉(zhuǎn)移酶的異常參與很多子宮疾病的發(fā)生發(fā)展，但組蛋白修飾和相關(guān)轉(zhuǎn)移酶的變化是否參與了煙草煙霧暴露對(duì)子宮的毒理作用和 TSA 的緩解過程，目前尚不清楚。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 60 日齡C57BL/6 ♀小鼠 36 只，體質(zhì)量(20.0±0.5)g，購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司，SCXK(遼)2015-0001。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)在中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院動(dòng)物中心 SPF 級(jí)動(dòng)物飼養(yǎng)室，SYXK(遼)2017-0004，室溫(22 ±3)℃，相對(duì)濕度(50±20)%。針對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的所有操作流程關(guān)注動(dòng)物福利，并通過中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(2013PS06K；2019PS263K)。

1.1.2試劑 雄獅牌香煙(每支含 0.7 mg 尼古丁和 8 mg 焦油)；組蛋白提取試劑盒(EPIGENTEK，批號(hào)：#OP-0006)；TSA(Sigma；批號(hào)：T1952)；免疫組化試劑盒(邁新，批號(hào)：KIT9921)；一抗來源：GAPDH(康成生物；批號(hào)：KC-5G4，規(guī)格：100 μL)；H3(ABclonal；批號(hào)：A2348)；H3K4me1(ABclonal；批號(hào)：A2355)；H3K4me2(ABclonal；批號(hào)：A2356)；H3K4me3(ABclonal；批號(hào)：A2357)；H3K9me1(ABclonal；批號(hào)：A2358)；H3K9me2(ABclonal；批號(hào)：A2359)；H3K9me3(ABclonal；批號(hào)：A2360)；H3K27me3(ACTIVEMOTIF；批號(hào)：61017)；GLP(R&D；批號(hào)：PP-B0422)；G9ɑ(MILLIPORE；批號(hào)：#09-071)；EZH2(CST；批號(hào)：5246S)；羊抗兔二抗(Abbkine；批號(hào)：A23620)；羊抗鼠二抗(Abbkine；批號(hào)：A25012)。

1.1.3實(shí)驗(yàn)儀器 Western blot垂直電泳系統(tǒng)(美國(guó)Hoffer公司)；Western blot轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)；RM2235石蠟切片機(jī)(德國(guó)Leica公司)；組織石蠟包埋機(jī)(湖北孝感闊海醫(yī)療公司)；低溫高速離心機(jī)(美國(guó)Thermo公司)；-80 ℃ 超低溫冰箱(美國(guó)Thermo公司)；電子天平(美國(guó)G&G公司)QS-RO型全自動(dòng)超純水機(jī)(沈陽(yáng)惠思純水設(shè)備有限公司)；生物凈化工作臺(tái)(中國(guó)蘇凈安泰公司)；眼科剪刀、鑷子等必備手術(shù)器械(江蘇寵寶集團(tuán)醫(yī)療器械有限公司)。

1.2 研究方法

1.2.1煙草煙霧暴露小鼠模型 將36只C57 BL/6 ♀小鼠按隨機(jī)分組的方法分為對(duì)照組、CS 暴露組和 CS+TSA 組，每組 12 只，對(duì)每組內(nèi)的小鼠進(jìn)行編號(hào)，列表記錄它們的初始體質(zhì)量及狀態(tài)。自制實(shí)驗(yàn)性 CS 暴露裝置，CS 暴露方法參照本課題組前期實(shí)驗(yàn)[6-7]。CS 暴露組和 CS+TSA 組小鼠 CS 暴露時(shí)間為30 d，每天兩次 CS 暴露，每次 CS 暴露給兩支煙持續(xù)暴露 2 h，CS 暴露時(shí)間間隔為5 h。對(duì)照組小鼠吸入空氣。藥物 TSA(將 TSA 溶于DMSO，再用生理鹽水將其配制成濃度為 1.98×10-5mol·L-1的溶液)，按0.6 μg·g-1體質(zhì)量的劑量，每2 d 1次，腹腔內(nèi)注射給 CS+TSA 組小鼠。CS暴露30 d后，對(duì)處于發(fā)情期的雌性小鼠實(shí)施安樂死，并從每組中至少收集 5 個(gè)子宮組織用于進(jìn)一步研究。

1.2.2HE 染色 各組小鼠的子宮組織用 4% 多聚甲醛固定 24 h，再經(jīng)梯度酒精的洗滌與脫水以及二甲苯透明，浸在石蠟中進(jìn)行組織包埋，以 4 μm 厚度連續(xù)切片，然后進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn) HE 染色，中性樹脂封片后置于光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.3Western blot 提取各組小鼠子宮組織總蛋白和組蛋白，具體操作步驟參照試劑盒說明書。然后將提取的各組子宮組織的蛋白進(jìn)行 SDS-PAGE 電泳，分別用 GAPDH(1 ∶10 000)；H3(1 ∶1 000)；H3K4me1(1 ∶200)；H3K4me2(1 ∶200)；H3K4me3(1 ∶200)；H3K9me1(1 ∶200)；H3K9me2(1 ∶200)；H3K9me3(1 ∶200)；H3K27me3(1 ∶300)；GLP(1 ∶400)；G9ɑ(1 ∶400)和 EZH2(1 ∶200)抗體孵育。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后用 Image-J 軟件對(duì)光密度值進(jìn)行定量檢測(cè)，對(duì)不同分子量蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用 GraphPad Prism 7.00 統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 TSA 抑制 CS 暴露導(dǎo)致的子宮組織結(jié)構(gòu)改變CS 暴露后小鼠的子宮濕重降低，子宮肌層變薄、腺體和間質(zhì)細(xì)胞數(shù)目減少，TSA 可以有效抑制 CS 暴露引起的小鼠子宮的上述形態(tài)學(xué)改變(見Fig 1)。以上 CS 暴露導(dǎo)致的子宮組織結(jié)構(gòu)改變和TSA 對(duì)子宮損傷的改善和我們先前的研究結(jié)果一致[6]。

Fig 1 TSA relieved changes in uterine tissue morphology caused by CS exposureHE staining was used to observe the morphology of mouse uterus in the control group,CS exposed group and CS exposed+TSA group)

2.2 TSA 抑制 CS 暴露誘導(dǎo)的小鼠子宮組織組蛋白 H3K9me1 修飾水平變化采用 Western blot 技術(shù)檢測(cè)了各組(對(duì)照組、CS 暴露組和 CS+TSA 組)小鼠子宮組織組蛋白中 H3K4me1、H3K4me2、H3K4me3、H3K9me1、H3K9me2、H3K9me3和H3K27me3總的修飾水平，結(jié)果表明，CS 暴露后小鼠子宮組織總 H3K9me1 表達(dá)水平明顯升高，TSA有效抑制了 CS 暴露誘導(dǎo)的小鼠子宮組織 H3K9me1 的表達(dá)。此外，CS 暴露后小鼠子宮組織總 H3K27me3 表達(dá)水平明顯升高，TSA進(jìn)一步激活了小鼠子宮組織總 H3K27me3 表達(dá)水平。其他檢測(cè)的組蛋白總的修飾水平在各鼠子宮組織中的改變差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見Fig 2)。因此，結(jié)果表明 H3K9me1 和 H3K27me3 組蛋白修飾水平變化參與煙草煙霧對(duì)小鼠子宮的損傷過程，且 H3K9me1 組蛋白修飾水平的變化在TSA 緩解的煙草煙霧暴露所致的小鼠子宮損傷過程中發(fā)揮重要作用。

Fig 2 Histone modifications involved in process of uterine injury alleviated by TSA in female mice induced by CS exposure (,n=3)Western blot results showed that TSA significantly inhibited global H3K9me1 modification and further aggravated H3K27me3 change induced by CS exposure.*P<0.05 vs control;#P<0.05 vs CS

2.3 組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶在小鼠子宮組織中的表達(dá)H3K9me1 和 H3K27me3 組蛋白修飾水平變化參與 CS對(duì)小鼠子宮的損傷過程，為了探索組蛋白修飾水平改變的機(jī)制，我們進(jìn)一步檢測(cè)了各組小鼠子宮組織中組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶 GLP(H3K9 甲基轉(zhuǎn)移酶)、G9ɑ(H3K9 甲基轉(zhuǎn)移酶)和EZH2(H3K27me3 甲基轉(zhuǎn)移酶)的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：CS暴露后小鼠子宮組織 GLP 和 G9ɑ 表達(dá)水平增加，TSA抑制了 CS 暴露激活的小鼠子宮組織 GLP和G9ɑ的表達(dá)。此外，CS暴露后小鼠子宮組織中EZH2表達(dá)水平增加，應(yīng)用TSA后進(jìn)一步激活了CS暴露誘導(dǎo)的EZH2表達(dá)水平(見Fig 3)。我們的研究結(jié)果表明：組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶(GLP、G9α、EZH2)表達(dá)水平的增加在煙草煙霧對(duì)小鼠子宮的損傷中發(fā)揮作用，GLP、G9α和TSA改善在CS暴露引起的子宮組織形態(tài)改變過程中起到一定的作用。

Fig 3 Histone methyltransferase involved in process of uterine injury alleviated by TSA in female mice induced by CS exposure (,n=3)TSA suppressed GLP and G9ɑ expression in mice uterine tissue induced by CS exposure,but further activated EZH2 increase.*P<0.05 vs control;#P<0.05 vs CS

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，CS暴露后小鼠的子宮腺體和間質(zhì)細(xì)胞數(shù)目減少，TSA 可以有效抑制 CS 暴露引起的小鼠子宮的上述形態(tài)學(xué)改變。以上 CS 暴露導(dǎo)致的子宮組織結(jié)構(gòu)改變和 TSA 對(duì)子宮損傷的改善和我們先前的研究結(jié)果一致[7]。研究發(fā)現(xiàn) CS 中的有害物質(zhì)可以導(dǎo)致肺上皮細(xì)胞中 DNA 甲基化和組蛋白修飾發(fā)生變化[13-15]。但是，在子宮組織中 CS 暴露能否通過改變組蛋白修飾參與其對(duì)子宮的毒理作用和 TSA 的緩解過程，目前尚不清楚。為進(jìn)一步探究組蛋白修飾水平變化在 CS 暴露對(duì)小鼠子宮的毒理作用以及在 TSA 對(duì)子宮損傷的改善中的作用，我們采用 Western blot 技術(shù)檢測(cè)了各組小鼠子宮組織組蛋白中H3K4me1、H3K4me2、H3K4me3、H3K9me1、H3K9me2、H3K9me3和H3K27me3總的修飾水平。結(jié)果表明：H3K9me1 和 H3K27me3 組蛋白修飾水平變化參與 CS 對(duì)小鼠子宮的損傷過程，且 H3K9me1 組蛋白修飾水平的變化在 TSA 緩解的 CS 暴露所致的小鼠子宮損傷過程中發(fā)揮重要作用。環(huán)境毒素可以通過表觀遺傳學(xué)機(jī)制影響基因表達(dá)水平。本研究發(fā)現(xiàn) G9ɑ 和 GLP 調(diào)節(jié)的總 H3K9me1 組蛋白修飾水平變化參與 CS 對(duì)小鼠子宮的損傷和 TSA 的緩解過程。但是，H3K9me1 組蛋白修飾水平變化后影響了下游哪些基因的表達(dá)，目前尚不清楚。我們前期發(fā)現(xiàn) CS 暴露能夠通過激活小鼠子宮組織中 HDAC1/2、mTOR和P2RX7介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡導(dǎo)致子宮肌層和子宮內(nèi)膜變薄，而 TSA 可以抑制 HDAC1/2、mTOR和P2RX7的活化，緩解 CS 暴露引起的子宮組織形態(tài)改變[6-7]。CS 暴露和 TSA 處理后子宮組織中 HDAC1/2、mTOR 和 P2RX7表達(dá)水平的變化是否和 H3K9me1 組蛋白修飾水平變化有關(guān)，值得我們后續(xù)深入研究。

我們進(jìn)一步檢測(cè)了各組小鼠子宮組織中組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶 GLP(H3K9 甲基轉(zhuǎn)移酶)、G9α(H3K9 甲基轉(zhuǎn)移酶)和EZH2(H3K27me3 甲基轉(zhuǎn)移酶)的表達(dá)水平。CS 暴露后小鼠子宮組織GLP和G9α表達(dá)水平增加，TSA抑制了CS暴露激活的小鼠子宮組織 GLP和G9α的表達(dá)。此外，CS暴露后小鼠子宮組織中EZH2表達(dá)水平增加，應(yīng)用TSA后進(jìn)一步激活了CS暴露誘導(dǎo)的 EZH2表達(dá)水平。我們的研究結(jié)果表明：組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶(GLP、G9α、EZH2)表達(dá)水平的增加在煙草煙霧對(duì)小鼠子宮的損傷中發(fā)揮作用。此外，GLP、G9α在TSA改善CS暴露引起的子宮組織形態(tài)改變過程中起到一定的作用。組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶(GLP、G9α和EZH2)在子宮組織中的作用，目前很少文獻(xiàn)報(bào)道。G9ɑ(H3K9甲基轉(zhuǎn)移酶)在子宮內(nèi)膜癌組織中表達(dá)升高，G9ɑ 通過抑制 E-cadherin 影響內(nèi)膜癌的轉(zhuǎn)移和進(jìn)展。提示 G9ɑ 調(diào)節(jié)的表觀遺傳通路可能作為子宮內(nèi)膜癌的潛在治療靶點(diǎn)[16]。新生兒暴露于二乙雌酚可引起小鼠子宮癌，DES可明顯降低 EZH2、組蛋白賴氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶2A和組蛋白去乙酰化酶 HDAC1、HDAC2 和 HDAC3 的表達(dá)水平[17]。子宮組織中 EZH2 的表達(dá)水平和子宮的發(fā)育階段和激素水平有關(guān)，EZH2 表達(dá)缺失可導(dǎo)致異常的子宮上皮增生、子宮肥大，表明 EZH2 在子宮發(fā)育和功能中起著至關(guān)重要的作用[18]。本研究中發(fā)現(xiàn) CS 暴露后小鼠子宮組織組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶 GLP、G9α和EZH2 表達(dá)水平增加，表明這些酶的激活和 CS 暴露對(duì)子宮組織的損傷有關(guān)。提示GLP、G9ɑ EZH2可能作為靶向治療煙草煙霧暴露導(dǎo)致的女性生育能力受損的新的靶點(diǎn)。然而，TSA 進(jìn)一步加劇煙草煙霧暴露激活的 EZH2 和 H3K27me3 修飾水平變化。提示：TSA對(duì)煙草煙霧暴露激活的 EZH2 和 H3K27me3 修飾水平?jīng)]有緩解作用。

綜上所述，組蛋白修飾變化參與 TSA 緩解的煙草煙霧暴露所致的小鼠子宮損傷過程。本研究為闡明表觀遺傳機(jī)制在煙草煙霧暴露導(dǎo)致的女性生育能力受損中提供了前期基礎(chǔ)，為未來治療吸煙引起的女性不孕提供了新的靶點(diǎn)和思路。