組蛋白修飾變化參與曲古抑菌素A緩解的煙草煙霧暴露所致小鼠子宮損傷過程

婁 毅 ,叢艷飛 ,丁晶晶 ,李 芳 ,王莉莉

(1.中國醫科大學基礎醫學院醫學遺傳學教研室，遼寧 沈陽 110122;2.中國醫科大學附屬盛京醫院實驗研究中心，遼寧 本溪 117000)

中國是世界上最大的煙草生產和消費國，2002 年中國女性居民主動吸煙率為3.1%，被動吸煙率高達54.6%[1]。煙草煙霧(cigarette smoke，CS)中含有多環芳香烴(PAHs)、苯并芘(BaP)、尼古丁、生物堿和重金屬等 4 000 多種有害化學物質[2]。研究發現，吸煙會使處于育齡期的女性生育力下降[3]，口服尼古丁會導致大鼠子宮腔上皮和腺上皮形態學改變[4]，CS 暴露可導致子宮 MMP-9、CXCR4和ER的表達增加[5]。我們前期的研究表明，CS暴露通過激活組蛋白脫乙酰基酶1/2(histone deacetylase，HDAC)，導致小鼠子宮肌層和子宮內膜變薄，腺體組織和間質細胞明顯減少等組織形態學改變，TSA，HDAC的通用抑制劑，通過抑制 HDAC 1/2 和 mTOR 的激活，重新激活自噬，改善CS暴露引起的小鼠子宮組織形態學改變[6]。此外，我們還發現 P2RX7介導的細胞焦亡和凋亡參與了 TSA 緩解的CS 暴露所致的小鼠子宮損傷過程[7]。因此，進一步探究煙草煙霧暴露對女性生育能力影響的相關分子機制將為提高女性生育健康做出一定貢獻。

環境毒素可以通過表觀遺傳學機制影響基因表達水平，進而影響個體的表型或者疾病的易感性[8]。表觀遺傳學修飾包括翻譯后的組蛋白修飾，如組蛋白的乙酰化和甲基化修飾、DNA的甲基化修飾等，表觀遺傳修飾在轉錄調節中發揮重要作用[9-10]。組蛋白修飾水平變化和相關組蛋白修飾轉移酶的變化和很多子宮疾病有關[11-14]。在子宮內膜異位癥的異位內膜組織中發現全組蛋白 H3K4 和 H3K9 的低甲基化，說明組蛋白修飾異常在子宮內膜異位癥的發病中發揮重要作用[11]。子宮內膜異位癥患者的異位子宮內膜中 H3K27me3 陽性細胞百分比明顯低于正常分泌型子宮內膜。此外，H3K27me3 的甲基轉移酶 EZH2 在子宮內膜異位癥上皮細胞中高水平表達。提示 H3K27me3 在子宮內膜異位癥發病中的作用和 EZH2 可能作為該疾病的潛在治療靶點[12]。以上結果表明，組蛋白修飾和相關轉移酶的異常參與很多子宮疾病的發生發展，但組蛋白修飾和相關轉移酶的變化是否參與了煙草煙霧暴露對子宮的毒理作用和 TSA 的緩解過程，目前尚不清楚。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 60 日齡C57BL/6 ♀小鼠 36 只，體質量(20.0±0.5)g，購自遼寧長生生物技術有限公司，SCXK(遼)2015-0001。實驗動物飼養在中國醫科大學附屬盛京醫院動物中心 SPF 級動物飼養室，SYXK(遼)2017-0004，室溫(22 ±3)℃，相對濕度(50±20)%。針對實驗動物的所有操作流程關注動物福利，并通過中國醫科大學附屬盛京醫院醫學倫理委員會批準(2013PS06K；2019PS263K)。

1.1.2試劑 雄獅牌香煙(每支含 0.7 mg 尼古丁和 8 mg 焦油)；組蛋白提取試劑盒(EPIGENTEK，批號：#OP-0006)；TSA(Sigma；批號：T1952)；免疫組化試劑盒(邁新，批號：KIT9921)；一抗來源：GAPDH(康成生物；批號：KC-5G4，規格：100 μL)；H3(ABclonal；批號：A2348)；H3K4me1(ABclonal；批號：A2355)；H3K4me2(ABclonal；批號：A2356)；H3K4me3(ABclonal；批號：A2357)；H3K9me1(ABclonal；批號：A2358)；H3K9me2(ABclonal；批號：A2359)；H3K9me3(ABclonal；批號：A2360)；H3K27me3(ACTIVEMOTIF；批號：61017)；GLP(R&D；批號：PP-B0422)；G9ɑ(MILLIPORE；批號：#09-071)；EZH2(CST；批號：5246S)；羊抗兔二抗(Abbkine；批號：A23620)；羊抗鼠二抗(Abbkine；批號：A25012)。

1.1.3實驗儀器 Western blot垂直電泳系統(美國Hoffer公司)；Western blot轉膜系統(美國Bio-Rad公司)；RM2235石蠟切片機(德國Leica公司)；組織石蠟包埋機(湖北孝感闊海醫療公司)；低溫高速離心機(美國Thermo公司)；-80 ℃ 超低溫冰箱(美國Thermo公司)；電子天平(美國G&G公司)QS-RO型全自動超純水機(沈陽惠思純水設備有限公司)；生物凈化工作臺(中國蘇凈安泰公司)；眼科剪刀、鑷子等必備手術器械(江蘇寵寶集團醫療器械有限公司)。

1.2 研究方法

1.2.1煙草煙霧暴露小鼠模型 將36只C57 BL/6 ♀小鼠按隨機分組的方法分為對照組、CS 暴露組和 CS+TSA 組，每組 12 只，對每組內的小鼠進行編號，列表記錄它們的初始體質量及狀態。自制實驗性 CS 暴露裝置，CS 暴露方法參照本課題組前期實驗[6-7]。CS 暴露組和 CS+TSA 組小鼠 CS 暴露時間為30 d，每天兩次 CS 暴露，每次 CS 暴露給兩支煙持續暴露 2 h，CS 暴露時間間隔為5 h。對照組小鼠吸入空氣。藥物 TSA(將 TSA 溶于DMSO，再用生理鹽水將其配制成濃度為 1.98×10-5mol·L-1的溶液)，按0.6 μg·g-1體質量的劑量，每2 d 1次，腹腔內注射給 CS+TSA 組小鼠。CS暴露30 d后，對處于發情期的雌性小鼠實施安樂死，并從每組中至少收集 5 個子宮組織用于進一步研究。

1.2.2HE 染色 各組小鼠的子宮組織用 4% 多聚甲醛固定 24 h，再經梯度酒精的洗滌與脫水以及二甲苯透明，浸在石蠟中進行組織包埋，以 4 μm 厚度連續切片，然后進行標準 HE 染色，中性樹脂封片后置于光學顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.3Western blot 提取各組小鼠子宮組織總蛋白和組蛋白，具體操作步驟參照試劑盒說明書。然后將提取的各組子宮組織的蛋白進行 SDS-PAGE 電泳，分別用 GAPDH(1 ∶10 000)；H3(1 ∶1 000)；H3K4me1(1 ∶200)；H3K4me2(1 ∶200)；H3K4me3(1 ∶200)；H3K9me1(1 ∶200)；H3K9me2(1 ∶200)；H3K9me3(1 ∶200)；H3K27me3(1 ∶300)；GLP(1 ∶400)；G9ɑ(1 ∶400)和 EZH2(1 ∶200)抗體孵育。實驗結束后用 Image-J 軟件對光密度值進行定量檢測，對不同分子量蛋白的表達情況進行分析。

1.3 統計學分析應用 GraphPad Prism 7.00 統計軟件分析數據，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。

2 結果

2.1 TSA 抑制 CS 暴露導致的子宮組織結構改變CS 暴露后小鼠的子宮濕重降低，子宮肌層變薄、腺體和間質細胞數目減少，TSA 可以有效抑制 CS 暴露引起的小鼠子宮的上述形態學改變(見Fig 1)。以上 CS 暴露導致的子宮組織結構改變和TSA 對子宮損傷的改善和我們先前的研究結果一致[6]。

Fig 1 TSA relieved changes in uterine tissue morphology caused by CS exposureHE staining was used to observe the morphology of mouse uterus in the control group,CS exposed group and CS exposed+TSA group)

2.2 TSA 抑制 CS 暴露誘導的小鼠子宮組織組蛋白 H3K9me1 修飾水平變化采用 Western blot 技術檢測了各組(對照組、CS 暴露組和 CS+TSA 組)小鼠子宮組織組蛋白中 H3K4me1、H3K4me2、H3K4me3、H3K9me1、H3K9me2、H3K9me3和H3K27me3總的修飾水平，結果表明，CS 暴露后小鼠子宮組織總 H3K9me1 表達水平明顯升高，TSA有效抑制了 CS 暴露誘導的小鼠子宮組織 H3K9me1 的表達。此外，CS 暴露后小鼠子宮組織總 H3K27me3 表達水平明顯升高，TSA進一步激活了小鼠子宮組織總 H3K27me3 表達水平。其他檢測的組蛋白總的修飾水平在各鼠子宮組織中的改變差異無統計學意義(見Fig 2)。因此，結果表明 H3K9me1 和 H3K27me3 組蛋白修飾水平變化參與煙草煙霧對小鼠子宮的損傷過程，且 H3K9me1 組蛋白修飾水平的變化在TSA 緩解的煙草煙霧暴露所致的小鼠子宮損傷過程中發揮重要作用。

Fig 2 Histone modifications involved in process of uterine injury alleviated by TSA in female mice induced by CS exposure (,n=3)Western blot results showed that TSA significantly inhibited global H3K9me1 modification and further aggravated H3K27me3 change induced by CS exposure.*P<0.05 vs control;#P<0.05 vs CS

2.3 組蛋白甲基轉移酶在小鼠子宮組織中的表達H3K9me1 和 H3K27me3 組蛋白修飾水平變化參與 CS對小鼠子宮的損傷過程，為了探索組蛋白修飾水平改變的機制，我們進一步檢測了各組小鼠子宮組織中組蛋白甲基轉移酶 GLP(H3K9 甲基轉移酶)、G9ɑ(H3K9 甲基轉移酶)和EZH2(H3K27me3 甲基轉移酶)的表達水平。結果發現：CS暴露后小鼠子宮組織 GLP 和 G9ɑ 表達水平增加，TSA抑制了 CS 暴露激活的小鼠子宮組織 GLP和G9ɑ的表達。此外，CS暴露后小鼠子宮組織中EZH2表達水平增加，應用TSA后進一步激活了CS暴露誘導的EZH2表達水平(見Fig 3)。我們的研究結果表明：組蛋白甲基轉移酶(GLP、G9α、EZH2)表達水平的增加在煙草煙霧對小鼠子宮的損傷中發揮作用，GLP、G9α和TSA改善在CS暴露引起的子宮組織形態改變過程中起到一定的作用。

Fig 3 Histone methyltransferase involved in process of uterine injury alleviated by TSA in female mice induced by CS exposure (,n=3)TSA suppressed GLP and G9ɑ expression in mice uterine tissue induced by CS exposure,but further activated EZH2 increase.*P<0.05 vs control;#P<0.05 vs CS

3 討論

本研究發現，CS暴露后小鼠的子宮腺體和間質細胞數目減少，TSA 可以有效抑制 CS 暴露引起的小鼠子宮的上述形態學改變。以上 CS 暴露導致的子宮組織結構改變和 TSA 對子宮損傷的改善和我們先前的研究結果一致[7]。研究發現 CS 中的有害物質可以導致肺上皮細胞中 DNA 甲基化和組蛋白修飾發生變化[13-15]。但是，在子宮組織中 CS 暴露能否通過改變組蛋白修飾參與其對子宮的毒理作用和 TSA 的緩解過程，目前尚不清楚。為進一步探究組蛋白修飾水平變化在 CS 暴露對小鼠子宮的毒理作用以及在 TSA 對子宮損傷的改善中的作用，我們采用 Western blot 技術檢測了各組小鼠子宮組織組蛋白中H3K4me1、H3K4me2、H3K4me3、H3K9me1、H3K9me2、H3K9me3和H3K27me3總的修飾水平。結果表明：H3K9me1 和 H3K27me3 組蛋白修飾水平變化參與 CS 對小鼠子宮的損傷過程，且 H3K9me1 組蛋白修飾水平的變化在 TSA 緩解的 CS 暴露所致的小鼠子宮損傷過程中發揮重要作用。環境毒素可以通過表觀遺傳學機制影響基因表達水平。本研究發現 G9ɑ 和 GLP 調節的總 H3K9me1 組蛋白修飾水平變化參與 CS 對小鼠子宮的損傷和 TSA 的緩解過程。但是，H3K9me1 組蛋白修飾水平變化后影響了下游哪些基因的表達，目前尚不清楚。我們前期發現 CS 暴露能夠通過激活小鼠子宮組織中 HDAC1/2、mTOR和P2RX7介導的細胞焦亡導致子宮肌層和子宮內膜變薄，而 TSA 可以抑制 HDAC1/2、mTOR和P2RX7的活化，緩解 CS 暴露引起的子宮組織形態改變[6-7]。CS 暴露和 TSA 處理后子宮組織中 HDAC1/2、mTOR 和 P2RX7表達水平的變化是否和 H3K9me1 組蛋白修飾水平變化有關，值得我們后續深入研究。

我們進一步檢測了各組小鼠子宮組織中組蛋白甲基轉移酶 GLP(H3K9 甲基轉移酶)、G9α(H3K9 甲基轉移酶)和EZH2(H3K27me3 甲基轉移酶)的表達水平。CS 暴露后小鼠子宮組織GLP和G9α表達水平增加，TSA抑制了CS暴露激活的小鼠子宮組織 GLP和G9α的表達。此外，CS暴露后小鼠子宮組織中EZH2表達水平增加，應用TSA后進一步激活了CS暴露誘導的 EZH2表達水平。我們的研究結果表明：組蛋白甲基轉移酶(GLP、G9α、EZH2)表達水平的增加在煙草煙霧對小鼠子宮的損傷中發揮作用。此外，GLP、G9α在TSA改善CS暴露引起的子宮組織形態改變過程中起到一定的作用。組蛋白甲基轉移酶(GLP、G9α和EZH2)在子宮組織中的作用，目前很少文獻報道。G9ɑ(H3K9甲基轉移酶)在子宮內膜癌組織中表達升高，G9ɑ 通過抑制 E-cadherin 影響內膜癌的轉移和進展。提示 G9ɑ 調節的表觀遺傳通路可能作為子宮內膜癌的潛在治療靶點[16]。新生兒暴露于二乙雌酚可引起小鼠子宮癌，DES可明顯降低 EZH2、組蛋白賴氨酸乙酰轉移酶2A和組蛋白去乙酰化酶 HDAC1、HDAC2 和 HDAC3 的表達水平[17]。子宮組織中 EZH2 的表達水平和子宮的發育階段和激素水平有關，EZH2 表達缺失可導致異常的子宮上皮增生、子宮肥大，表明 EZH2 在子宮發育和功能中起著至關重要的作用[18]。本研究中發現 CS 暴露后小鼠子宮組織組蛋白甲基轉移酶 GLP、G9α和EZH2 表達水平增加，表明這些酶的激活和 CS 暴露對子宮組織的損傷有關。提示GLP、G9ɑ EZH2可能作為靶向治療煙草煙霧暴露導致的女性生育能力受損的新的靶點。然而，TSA 進一步加劇煙草煙霧暴露激活的 EZH2 和 H3K27me3 修飾水平變化。提示：TSA對煙草煙霧暴露激活的 EZH2 和 H3K27me3 修飾水平沒有緩解作用。

綜上所述，組蛋白修飾變化參與 TSA 緩解的煙草煙霧暴露所致的小鼠子宮損傷過程。本研究為闡明表觀遺傳機制在煙草煙霧暴露導致的女性生育能力受損中提供了前期基礎，為未來治療吸煙引起的女性不孕提供了新的靶點和思路。