黃芩苷對脂多糖致內皮細胞炎癥反應的保護作用及機制研究

路青瑜，郭 麗，張啟云，楊付梅，李 嬌，孫黔云

(貴州醫科大學省部共建藥用植物功效與利用國家重點實驗室，貴州省中國科學院天然產物化學重點實驗室，貴州 貴陽 550014)

內皮細胞作為機體重要的代謝和內分泌器官，在調節血管功能方面起著重要作用[1]，其活化和損傷與動脈粥樣硬化、高血壓、糖尿病血管病變等多種心腦血管疾病的發生和發展密切相關[2]。在損傷細胞的諸多因素中，脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)是一個重要因素。LPS作為刺激內皮細胞產生炎癥反應的強效物質，在膿毒癥、中毒性休克、全身性炎癥反應綜合征和多臟器功能障礙綜合征中扮演了重要的角色。干預LPS的炎癥損傷一直是研究的熱點。黃芩苷(Baicalin)是傳統中藥黃芩中的重要活性成分，具有清熱解毒、抗腫瘤、降糖降脂、保肝及抗炎等作用[4]。近年來研究表明黃芩苷對LPS誘導的細胞炎癥損傷具有干預作用[5-7]，但其保護作用及機制仍有待進一步深入研究。本研究基于前期的篩選，開展了黃芩苷對脂多糖誘導的微血管內皮細胞炎癥反應的作用及機制研究，以進一步認識和挖掘黃芩苷的藥理活性。

1 材料

1.1 試劑胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)購于阿根廷Natocor-Industria Biológica公司；RPMI 1640培養基購自美國Gibco公司；Toll-like Receptor 4(TLR4)抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology公司(貨號：sc-293072)；NF-κB p65、p-NF-κB p65、β-actin抗體均購自美國CST公司，貨號分別為8242S、3033S、4970S；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自美國Promega公司；感受態細胞DH5α購自北京康為世紀生物科技有限公司；質粒小量提取試劑盒、Lipo6000TM脂質體轉染試劑、BCA蛋白定量試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒(增強型)、ECL超敏顯影液、NF-κB激活-核轉運試劑盒、鈣離子熒光探針Fluo-4 AM均購自于江蘇碧云天生物技術研究所；黃芩苷標準品購自于北京索萊寶生物科技有限公司(貨號：SB8020)；腫瘤壞死因子重組蛋白TNF-α購自北京義翹神州生物科技有限公司(貨號：10602-HNAE)；細胞間黏附分子1(intracellular adhesion molecule 1，ICAM-1)、白細胞介素6(interleukin 6,IL-6)、單核細胞趨化因子1(Monocyte chemoattractant protein 1，MCP-1)ELISA檢測試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司；吡咯烷二硫氨基甲酸(pyrrolidinedithiocarbamate，PDTC)、脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)均購自美國Sigma公司，貨號分別為P8765、L6529；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器NanoDrop 2000C 超微量分光光度計(美國Thermo公司)；TS2-S-SM倒置相差顯微鏡、TS2-FL倒置熒光顯微鏡(日本Nikon公司)；NovoCyte 2040R流式細胞儀(美國ACEA公司)；連續波長酶標儀Gen5(美國Bio Tek公司)；高內涵篩選系統CellInsight CX5(美國Thermo公司)；ESCO CLM-170B-8-NF CO2培養箱(新加坡ESCO公司)；GloMax 96化學發光檢測儀(美國Promega公司)；Fusion Fx Spectra化學發光成像分析系統(法國Vilber Lourmat公司)；Milli-Q Integral 超純水系統(美國Milipore公司)；電泳、轉印系統(美國Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 內皮細胞培養人微血管內皮細胞株(human microvasular endothelial cell，HMEC)HMEC由本實驗室傳代培養，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基于37 ℃，5% CO2條件下培養，收集對數生長期細胞進行實驗。

2.2 LPS對HMEC黏附分子及炎癥介質表達的影響將對數生長期的HMEC以1×104個/孔接種于96孔培養板，培養24 h后棄上清，加入90 μL不含血清的RPMI 1640培養基，再加入10 μL LPS(終濃度為5 mg·L-1)，同時設置正常對照組，分別培養0、6、12、24 h取上清用于測定ICAM-1、IL-6、MCP-1，上述各指標的測定均按照說明書進行。

2.3 黃芩苷對LPS刺激HMEC表達黏附分子及炎癥介質的影響

2.3.1黃芩苷樣品溶液的配制 準確稱取適量的黃芩苷，用DMSO完全溶解，配制成0.1 mol·L-1的溶液，分裝，于-80 ℃保存，臨用前化凍后用無血清培養基按10倍逐級稀釋至1.0×10-6、1.0×10-7、1.0×10-8mol·L-1。

2.3.2黃芩苷對LPS刺激HMEC表達MCP-1、ICAM-1、IL-6的影響 將對數生長期的HMEC以1×104個/孔接種于96孔培養板，培養24 h后棄上清，分別加入含不同濃度(基于前期篩選，黃芩苷的終濃度分別為1.0×10-6、1.0×10-7、1.0×10-8mol·L-1)黃芩苷的RPMI-1640培養基90 μL預處理細胞3 h，再加入10 μL LPS(終濃度為5 mg·L-1)，37 ℃培養12 h取培養上清進行MCP-1檢測，培養24 h取培養上清進行ICAM-1、IL-6檢測，同時分別設置模型組、正常對照組、陽性藥物組PDTC(1.0×10-5mol·L-1)

2.4 Ca2+內流的檢測

2.4.1熒光觀察Ca2+內流 將對數生長期的HMEC以1×104個/孔接種于96孔培養板，培養24 h后各組(組別設置同“2.3.2”)參照“2.3.2”進行相應處理，加入LPS刺激1 h，PBS洗3次，加入Ca2+熒光探針Fluo-4 AM于37 ℃孵育30 min，PBS洗3次，于37 ℃繼續孵育20 min，用熒光顯微鏡觀察Ca2+內流變化。

2.4.2流式細胞儀檢測鈣離子內流 將對數生長期的HMEC以2×104個/孔接種于48孔培養板，培養24 h后各組參照“2.3.2”進行相應處理(組別設置同“2.3.2”)，加入LPS刺激1 h，PBS洗1次，胰酶消化，離心收集細胞，PBS洗3次，加入鈣離子熒光探針Fluo-4 AM于37 ℃孵育30 min，PBS洗3次，于37 ℃繼續孵育20 min，然后加入PBS將細胞混勻成細胞懸液，于流式細胞儀上檢測，結果用相對熒光強度表示。

2.5 NF-κB p65入核的檢測將對數生長期的HMEC按1×104個/孔接種于96孔培養板，培養24 h后各組參照“2.3.2”進行相應處理，同時分別設置模型組、正常對照組、陽性藥物組(PDTC，終濃度為1.0×10-5mol·L-1)、陽性對照組(TNF-α，終濃度為100 μg·L-1)，加入LPS刺激3 h，采用免疫熒光法檢測NF-κB p65入核，操作按照NF-kB激活-核轉運試劑盒說明書進行，入核信號強度用內源性p65的細胞核熒光強度/細胞漿熒光強度(nuc/cyt fluorescence intensity)來計算，熒光強度采用Cellinsight Cx5軟件進行分析。共進行3次獨立實驗，每次實驗每個組別分別設置2個平行孔，每孔隨機選取9個視野進行拍攝和數據分析。

2.6 NF-kB轉錄活性的檢測

2.6.1質粒制備 質粒的制備及濃度檢測方法參照文獻[8]。

2.6.2雙熒光素報告基因檢測 將對數生長期的HMEC以1×104個/孔接種于不透光的96孔細胞培養板，培養24 h后進行轉染，棄去上清，換液，加入90 μL含血清的RPMI 1640培養基進行轉染，轉染16 h后棄上清，各組參照“2.3.2”進行相應處理，組別設置同2.3.2，加入LPS刺激6 h后進行熒光強度的檢測。具體方法和計算公式參照文獻[8]。

2.7Western blot檢測NF-κB p65、p-NF-κB p65及TLR4的表達 將HMEC按1×106個/瓶接種，培養24 h后各組(組別設置同“2.3.2”，其中黃芩苷的終濃度為1.0×10-6mol·L-1)參照“2.3.2”進行相應處理，加入LPS分別刺激6 h、24 h，棄去細胞培養液，用PBS進行沖洗，刮下細胞進行離心，按照蛋白抽提試劑盒進行蛋白抽提，BCA法測定蛋白濃度。進行10% SDS-PAGE電泳、轉膜、封閉，一抗孵育過夜，二抗孵育1 h，用化學發光成像系統進行曝光和顯影并進行量化分析。

3 結果

3.1 LPS對HMEC黏附分子及炎癥介質表達的影響

3.1.1LPS對HMEC表達黏附分子ICAM-1的影響 LPS刺激HMEC后ICAM-1的表達在12 h出現上調(Fig 1)，在24 h與對照組的差異有顯著性(P<0.01)。

Fig 1 Expression of ICAM-1 after HMEC **P<0.01 vs control

3.1.2LPS對HMEC表達炎癥介質的影響 LPS刺激HMEC后，IL-6、MCP-1在各時間點的表達均有不同程度的增加(Fig 2)，其中，IL-6的表達持續上調，在12 h、24 h與對照組的差異有顯著性(P<0.01)。MCP-1的表達也呈上調趨勢，在12 h達到峰值。

3.2 黃芩苷對HMEC黏附分子及炎癥介質表達變化的影響

3.2.1黃芩苷對LPS刺激HMEC表達ICAM-1的影響 黃芩苷對LPS刺激HMEC表達ICAM-1具有干預作用(Fig 3)，且抑制作用呈現一定的量效關系。

Fig 2 Expression of IL-6 and MCP-1 after HMEC exposure to A:IL-6;B:MCP-1.**P<0.01 vs control

Fig 3 Effect of baicalin on expression of ICAM-1 after HMEC exposure to **P<0.01 vs control;#P<0.05,##P<0.01 vs model

3.2.2黃芩苷對LPS刺激HMEC表達炎癥介質的影響 黃芩苷對LPS刺激HMEC表達IL-6、MCP-1具有干預作用(Fig 4)，且作用具有量效關系，其中中高劑量組與模型組的差異有統計學意義(P<0.05，P<0.01)。

Fig 4 Effect of baicalin on expression of IL-6 and MCP-1 after HMEC exposure to A:IL-6;B:MCP-1.**P<0.01 vs control;#P<0.05,##P<0.01 vs model

3.3 黃芩苷對Ca2+內流的影響HMEC受LPS刺激后，發生了明顯的Ca2+內流，細胞內的Ca2+與Fluo-4結合后產生綠色熒光，黃芩苷對Ca2+內流有抑制作用(Fig 5)。采用流式細胞儀定量測定結果表明，模型組的Ca2+內流與對照組相比，差異有顯著性(P<0.05)。3個濃度的黃芩苷對Ca2+內流均有抑制作用(Fig 6)，其中高濃度組與模型組相比，差異有顯著性(P<0.05)。

3.4 黃芩苷對NF-κB p65入核的影響HMEC受到刺激后，其核內熒光強度增加(Fig 7)，模型組細胞核熒光強度/細胞質熒光強度(nuc/cyt fluorescence intensity)比值高于對照組(Fig 8)，差異有統計學意義(P<0.05)。高劑量組黃芩苷的熒光強度比值降低，與模型組相比，差異有顯著性(P<0.05)。

3.5 黃芩苷對NF-κB核轉錄活性的影響LPS刺激HMEC后，NF-κB p65核轉錄活性上調(Fig 9)，而黃芩苷對LPS所致的核轉錄活性增強有干預作用，結果呈現量效關系，其中高劑量組與模型組的差異有顯著性(P<0.05)。

Fig 5 Effect of baicalin on influx of calcium observed by fluorescence after HMEC exposure to LPS(×100)A:Control group;B:Model group;C:PDTC group;D:Baicalin high dose group;E:Baicalin middle dose group;F:Baicalin low dose group

Fig 6 Effect of baicalin on relative fluorescence intensity of influx of calcium ion measured by flow cytometry after HMEC exposure to *P<0.05 vs control;#P<0.05 vs model

3.6 黃芩苷對蛋白NF-κB p65、p-NF-κB及TLR4表達的影響Western blot檢測結果表明，p-NF-κB p65、TLR4及NF-κB p65的表達均上調(Fig 10)，其中模型組p-NF-κB p65、TLR4的表達與對照組相比，差異有顯著性(P<0.05，P<0.01)。而采用高劑量的黃芩苷干預后，p-NF-κB p65、TLR4及NF-κB p65的表達明顯下調，與模型組相比，差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。

Fig 7 Effect of baicalin on the nuclear translocation of NF-κB p65 after HMEC exposure to LPS(×200，n=3)nuclei with DAPI staining,blue;NF-κB p65 with Cy3 staining,red

Fig 8 Effect of baicalin on nuc/cyt fluorescence intensity of NF-κB p65 after HMEC exposure to *P<0.05,**P<0.01 vs control;#P<0.05 vs model

Fig 9 Effect of baicalin on transcriptional activity of NF-κB p65 after HMEC exposure to *P<0.05 vs control;#P<0.05 vs model

Fig 10 Effect of baicalin on expression of p-NF-κB p65,TLR4 and NF-κB p65 after HMEC exposure to *P<0.05,**P<0.01 vs control;#P<0.05,##P<0.01 vs model

4 討論

LPS是革蘭陰性菌細胞壁的正常結構成分，在嚴重創傷、感染等應激狀態下，大量LPS釋放入血，從而啟動炎癥和損傷[9]。當內皮細胞受到LPS刺激時，TLR4被激活，進而通過信號轉導系統激活內皮細胞，合成和釋放多種細胞因子和炎性介質，從而引起嚴重的炎癥反應[10]，這與心血管疾病的發生和發展密切相關，故對血管內皮細胞炎癥的抑制成為近年來心腦血管疾病防治的熱點。中藥黃芩是我國的大宗中藥材，主要具有清熱燥濕、瀉火解毒、涼血止血等功效[11]。黃芩苷是黃芩中的主要活性成分，近年來研究發現其具有廣泛的藥理特性，如抗炎[5-7,12]、抗腫瘤、抗氧化、抗菌和抗病毒等[4]。為了進一步認識和挖掘黃芩苷的藥理活性，本研究著眼于LPS誘導的早期炎癥反應啟動階段的干預，采用微血管內皮細胞開展黃芩苷對炎癥反應的干預研究。

在本研究中，LPS刺激HMEC后，發生了明顯的炎癥反應。Ca2+發生明顯內流，NF-κB通路活化，NF-κB p65磷酸化，NF-κB p65入核，核轉錄活性上調，黏附分子ICAM-1及炎癥介質IL-6、MCP-1的表達均上調，蛋白NF-κB p65、p-NF-κB p65及TLR4的表達上調。在給予黃芩苷預處理后，Ca2+內流、NF-κB p65入核受到抑制，黏附分子、炎癥介質的表達，核內轉錄活性，TLR4和NF-κB蛋白的表達均下調，此結果表明黃芩苷能抑制LPS誘導的HMEC炎癥反應。NF-κB是炎癥中關鍵的轉錄因子，在靜息狀態下由P50 /P65 /IKB三聚體組成而處于非活化狀態。當內皮細胞受到脂多糖刺激后，LPS首先通過結合TLRs，從而在機體內被先天免疫系統識別，激活TLR4-MyD88信號轉導，進而活化NF-κB誘導激酶形成活化的IKKs復合體，使IKB發生磷酸化、泛素化及相關蛋白酶的水解，激活NF-κB信號通路，NF-κB p65轉移至細胞核內，從而誘導炎癥因子的活化表達，引發炎癥反應[13]。Ca2+作為介導細胞內多種生物學反應的第二信使，在維持細胞正常生理功能方面具有重要作用，此外，Ca2+穩態在維持細胞的增殖、分化和調控凋亡中發揮極其重要的作用[14-15]。研究表明，血管內皮細胞外的Ca2+經細胞膜上的鈣通道流入細胞內，導致細胞內游離Ca2+超載，從而造成血管內皮細胞損傷。本工作提示黃芩苷對LPS引起的HMEC炎癥反應作用的機制涉及到炎癥相關信號通路及Ca2+內流的變化。基于黃芩苷通過抑制NF-κB p65磷酸化、NF-κB p65入核及核內轉錄活性，從而降低后續相關炎癥分子及蛋白的表達，這一系列事件具有時間上的邏輯關系，提示黃芩苷是通過抑制NF-κB p65的磷酸化或更早階段的干預發揮保護作用；而在LPS刺激HMEC后1 h檢測到明顯的Ca2+內流，Ca2+內流與NF-κB信號通路活化這二者之間是否存在相互影響或調控的關系，仍待進一步深入研究。

綜上，本研究表明黃芩苷對LPS誘導的微血管內皮細胞炎癥具有保護作用，其機制涉及到Ca2+內流和NF-κB信號通路的活化。進一步深入研究其作用機制，將有助于認識和挖掘黃芩苷的藥理活性，為臨床應用及相關新藥的研究提供參考依據。

(致謝：本實驗在貴州省中國科學院天然產物化學重點實驗室藥理與生物活性研究中心實驗室完成，在此感謝課題組全體成員的支持和幫助。)