類葉升麻苷調(diào)節(jié)AKT/NFκB通路改善APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠的認知障礙作用

王冬青，高 莉，孔 征，閆 明

(1.新疆醫(yī)科大學藥學院，2.新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)藥研究所，新疆維吾爾醫(yī)方劑學重點實驗室，新疆 烏魯木齊 830011)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種神經(jīng)變性病，以進行性記憶力減退和獲得性知識喪失，直至日常生活活動能力完全喪失為特征，給社會和家庭帶來沉重負擔，成為嚴重的社會和醫(yī)療衛(wèi)生問題[1]。因此，在AD的藥物治療中，療效較高且毒副作用小的新型創(chuàng)新藥物研究成為當前有效干預(yù)治療AD的重要措施。但是AD的發(fā)病機制比較復(fù)雜，越來越多的證據(jù)顯示，細胞凋亡、細胞周期失調(diào)與AD有密切關(guān)系，影響著神經(jīng)元的易損性和神經(jīng)變性的途徑。AKT、NF-κB與細胞內(nèi)多種調(diào)節(jié)機制環(huán)節(jié)密切相關(guān)，影響細胞凋亡和細胞周期調(diào)控[2]。眾多研究結(jié)果也表明，許多細胞的繁殖和生存均受到AKT、NF-κB調(diào)控的影響，通過配體與受體之間的相互作用，激活下游信號級聯(lián)介質(zhì)[3]。一些研究發(fā)現(xiàn)，AD患者腦神經(jīng)元的凋亡率顯著高于正常人，眾多相關(guān)凋亡基因體現(xiàn)為高表達，故認為由凋亡基因介導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡是導(dǎo)致AD的主要原因[4]。目前研究的熱點在于對凋亡基因的調(diào)控，大量研究發(fā)現(xiàn)PI3-K/AKT信號通路是促細胞存活的通路之一，PI3-K在生長因子受體等胞外信號活化后，激活下游蛋白激酶AKT，活化的AKT可以磷酸化凋亡基因，進凋亡基因失活，從而抑制神經(jīng)元凋亡以及促進神經(jīng)元的存活。NFκB作為信號傳導(dǎo)途徑的樞紐，與免疫、腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及細胞凋亡的調(diào)節(jié)等聯(lián)系密切，是一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子，而NFκB活化過度是引起神經(jīng)細胞凋亡的主要原因。本課題的研究對象，類葉升麻苷(acteoside，AS)是苯乙醇苷類主要藥效成分之一，課題組前期對其改善腦損傷、改善學習記憶障礙、抗氧化、保護神經(jīng)細胞等方面也進行了研究[5]。AS能有效減輕神經(jīng)元損傷，起到神經(jīng)元功能保護作用、調(diào)控細胞凋亡和細胞周期，進而減輕神經(jīng)元損害發(fā)揮改善學習記憶能力的作用[6-7]。為了進一步探討AS增強學習記憶的作用和機制，本實驗從AKT、NF-κB抑制細胞凋亡而產(chǎn)生神經(jīng)細胞保護作用的角度，探究AS對APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠模型學習記憶的改善作用。

1 材料與方法

1.1 藥物及試劑AS(新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)藥研究所自制，純度 ≥98%，批號 201708)，鹽酸多奈哌齊片[衛(wèi)材(中國)藥業(yè)有限公司制造，批號1704062]，Anti-NF-κB p65(abcam，ab16502)，Anti-NFκB p65 phoshpo S536(abcam ab76302)，AKT Rabbit PolyAb (Proteintech，10176-2-AP)，p-AKT(Ser473)(ST，4060s)，phospho-AKT(Thr308)(ST，4056s)。

1.2 儀器IVC-Ⅱ型獨立送風隔離籠具(蘇州市馮氏實驗動物設(shè)備有限公司)，XR-XY1032曠場視頻分析系統(tǒng)(上海欣軟信息科技有限公司)，Go1510全波長酶標儀(Thermo Fisher Scientific Oy RatAStie 2.FL-01620 Vantaa.Finland)，Allegra 64R 離心機(BECKMAN)，TL2010S高通量組織研磨儀(SOP-EQ036)，SQP電子天平(賽多利斯科學儀器(北京)有限公司)，L92-1溫度及濕度黑匣子(杭州路格科技有限公司)，F(xiàn)JY2002-UV基因研究型超純水機(青島宮勒姆科技有限公司)，IMS-40全自動雪花制冰機(杭州三永德儀器儀表有限公司)，LDZM-80KCS-Ⅱ型立式壓力蒸汽滅菌鍋(上海申安醫(yī)療器械廠)，電泳儀(OMKS001，伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品(上海)有限公司)，搖床(1704625，海門市其林貝爾儀器制造有限公司，凝膠成像系統(tǒng)(20150168，伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品(上海)有限公司)。

1.3 實驗動物本實驗所需的SPF級小鼠共60只(C5710只，APP/PS1模型鼠50只♀♂各半)，許可證號：SCXK(京)2019-0008，單位名稱：北京華阜康生物科技股份有限公司。購買4月齡小鼠，體質(zhì)量(17-24) g。飼養(yǎng)于新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)藥研究所SPF級動物房，單籠飼養(yǎng)。室溫(21-25) ℃，相對濕度50%-60%，12 h明暗交替飼養(yǎng)，自由攝食飲水。

1.4 分組及給藥根據(jù)北京華阜康生物科技股份有限公司出具的基因證明對動物進行基因篩選，并通過Y迷宮篩選行為異常的小鼠，篩選出60只合格動物，♀♂各半，隨機分成6組。連續(xù)60 d每天灌胃給藥1次，每組給藥劑量為0.1 mL·10 kg-1，配制方法如下：正常對照組：(C57小鼠)，超純水；模型組：(APP/PS1小鼠)，超純水；多奈哌齊組：稱取鹽酸多奈哌齊片 56 mg，混懸于10 mL超純水后以2 mg·kg-1給藥；AS低劑量組：稱取AS 25 mg，混懸于10 mL超純水以25 mg·mg·kg-1給藥；AS中劑量組：稱取AS 50 mg，混懸于10 mL超純水以50 mg·mg·kg-1給藥；AS高劑量組：稱取AS 100 mg，混懸于10 mL超純水以100 mg·mg·kg-1給藥。

1.5 筑巢實驗筑巢實驗考察動物的社會活動及日常行為能力，分別于給藥前、給藥d 30、60進行筑巢實驗。將已裁剪好的大小相同的32塊5 cm × 5 cm的正方形紙屑均勻的散布在小鼠籠內(nèi)，使小鼠自由在籠內(nèi)自由活動12 h后，按照以下評分法對小鼠筑巢行為進行盲評，以此作為小鼠筑巢的成績，并進行統(tǒng)計學檢驗。1分，紙張仍然散落在籠子里，沒有咬痕；2分，紙張聚集到籠子的一側(cè)，但松散，沒有形狀明顯的巢和顯著的咬或折；3分，紙張聚集在一起但為相對扁平的巢穴，沒有明顯的咬痕；4分，紙張聚集形成一個深窩，并有明顯的咬痕。

1.6 新物體識別實驗新物體識別實驗(novel object recognition task,NORT)，用于考察小鼠非空間認知行為能力。整個實驗分為3個階段，適應(yīng)期是讓小鼠適應(yīng)環(huán)境，將小鼠背對操作者輕輕放入新物體識別實驗箱正中格，使其在開闊的箱體中適應(yīng)環(huán)境20 min，之后放回飼養(yǎng)籠；學習期是讓小鼠接觸適應(yīng)3 d。在箱體的一側(cè)壁的左右兩端放置兩個完全相同的物體a1及物體a2，使其熟悉探究物體及環(huán)境10 min。最后一階段為測試期：a1不變，a2跟換為b，新物體于舊物體等高等直徑，再次放入小鼠探索5 min，測試全過程視屏錄像，記錄小鼠探查新物體總時間Tb、總次數(shù)和探查舊物體總時間Ta、總次數(shù)以及優(yōu)先指數(shù)Preferential index(P.I)等指標，(P.I=[Tb/(Ta+Tb)×100%]檢驗小鼠的認知能力，評價小鼠對事物的辨認及記憶能力。

1.7 標本采集及處理摘眼球取血，取小鼠大腦，冰上剝離腦組織，迅速分離出皮層和海馬，分別裝于已知重量的EP管中，稱質(zhì)量后通過差減法計算質(zhì)量，置于-80 ℃冰箱備用。

1.8 Western blot檢測AKT、NFκB及相關(guān)蛋白的表達,首先用PBS磷酸鹽緩沖液洗滌，經(jīng)組織研磨儀裂解，離心，酶標儀蛋白定量，最后用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，60 V電壓轉(zhuǎn)膜后封閉，孵育一抗4 ℃過夜，孵育二抗,顯色，曝光。

2 結(jié)果

2.1 AS對小鼠筑巢實驗的影響筑巢實驗結(jié)果顯示(Fig 1，Tab 1)。在給藥前及給藥30 d各組并未出現(xiàn)顯著差異，總體評分在3分左右，給藥60 d結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組評分顯著降低(P<0.01)；與模型組相比，AS低、中、高劑量組的評分均顯著提升(P<0.05)，陽性藥多奈哌齊組評分也有提升，但未出現(xiàn)顯著性差異。這表明長期給藥，AS可以改善模型小鼠的筑巢行為能力。

Fig 1 Effect of AS on nesting experiments in APP/PS1 mice (,n=10)*P<0.05 vs control group;#P<0.05 vs model group

Tab 1 Effect of AS on nesting scores of APP/PS1 mice (,n=10)

2.2 AS對小鼠新物體識別實驗的影響NORT結(jié)果顯示(Fig 2，Tab 2)，在NORT測試期間，與正常組相比，模型組PI值降低(P<0.01)；與模型組相比，陽性藥組及AS給藥組PI值均顯著提升(P<0.05)。同時，模型組在新物體停留的時間較正常組顯著降低，正常組在新物體停留時間為模型組的2.71倍；與模型組相比，AS中、高劑量組在新物體的停留時間顯著增加，分別為模型組停留時間的2.60、2.75倍(P<0.01)，AS低劑量組與多奈哌齊組相比雖沒有顯著性差異，但均有提高的趨勢，在新物體的停留時間為模型組的1.98倍。其次，與正常組相比，模型鼠對新舊物體的總探索時間顯著減少(P<0.01)，正常組的總探索時間是模型組的2倍，與模型組相比，AS各給藥組同的陽性藥多奈哌齊一致，均有顯著提升。而各組小鼠在舊物體的停留時間沒有顯著性差異。

Tab 2 Effect of AS on object recognition memory of APP/PS1 mice (,n=10)

2.3 AS對APP/PS1模型鼠AKT及相關(guān)蛋白表達的影響經(jīng)Western blot檢測結(jié)果顯示(Fig 3)，在海馬中，與正常組比較，模型組小鼠p-AKT-308/AKT、p-AKT-473/AKT比值顯著降低(P<0.01)；與模型組比較，多奈哌齊組及AS低、中、高劑量組小鼠p-AKT-308/AKT、p-AKT-473/AKT比值均顯著升高(P<0.01)。同時，在皮層中，與正常組比較，模型組小鼠p-AKT-308/AKT、p-AKT-473/AKT比值顯著降低(P<0.01)；與模型組比較，AS低、中、高劑量組同多奈哌齊結(jié)果一致，p-AKT-473/AKT比值均有不同程度的升高(P<0.01或P<0.05)，對于p-AKT-308/AKT，AS低劑量組作用明顯，中、高劑量雖未出現(xiàn)顯著性差異，但有上升的趨勢。

Fig 2 Effect of AS on object recognition memory in APP/PS1 mice (,n=10)*P<0.05,**P<0.01 vs control group;#P<0.05,##P<0.01 vs model group

2.4 AS 對APP/PS1模型鼠NF-κB及相關(guān)蛋白表達的影響NFκB蛋白表達結(jié)果顯示(Fig 4)，在海馬組織中，與正常組相比，模型組NFκB p-p65/NFκB p65表達量明顯升高(P<0.01)。與模型組相比，陽性藥多奈哌齊及AS各給藥組均可顯著降低NFκB p-p65/NFκB p65的表達(P<0.01)，其中AS低劑量作用最明顯，比值降低21.95%。同時，在皮層中,與正常相比，模型組中的NFκB p-p65/NFκB p65比值顯著升高(P<0.01)；與模型組相比，陽性藥多奈哌齊及AS低中高劑量均可顯著降低NFκB p-p65/NFκB p65的表達(P<0.01)，這說明AS能下調(diào)NFκB的表達，從而發(fā)揮其神經(jīng)保護作用。

Fig 3 AS expression of AKT and phosphorylation sites Thr308,Ser473 proteins in mice(，n=3)*P<0.05,**P<0.01 vs control group;##P<0.01 vs model group.

Fig 4 Effect of AS on NFκB p-p65/NFκB p65 protein expression in mice ±s, n=3)**P<0.01 vs control group;##P<0.01 vs model group.

3 討論

筑巢實驗方法簡單易行，無太大的應(yīng)激刺激，可反映小鼠的社會行為和日常生活能力，已被作為動物行為學的一種新的手段與方法。給藥60 d發(fā)現(xiàn)，與正常組相比，模型組評分顯著降低，模型組小鼠多表現(xiàn)為無形狀明顯的巢或者巢相對扁平，紙張無明顯的咬痕；而AS給藥組評分顯著提升。這表明長期給藥，AS可以改善模型小鼠的筑巢行為能力。NORT實驗對動物來說無任何壓力，也不要求空間定位。它長期以來被用來衡量各種AD模型動物的學習和記憶能力。在NORT測試期間，模型組PI值降低，在新物體停留的時間降低，對新舊物體的總探索時間減少；而AS可以提升PI值，增加癡呆小鼠在新物體的停留時間和探索時間。說明阿爾茨海默癥小鼠對新物體探索興趣較低，AS可提高AD小鼠探索新物體的能力，使其在新事物處保持更長的停留時間，改善APP/ PS1癡呆小鼠的記憶，提升其對新物體的探索興趣。

APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠認知功能障礙出現(xiàn)的月齡一般在6-8月齡，故本實驗選取6月齡小鼠進行早期干預(yù)[8]。此時段動物模型正處于 Aβ 沉積的早期階段，出現(xiàn)的行為學障礙與AD患者病程早期認知功能障礙相似，能較好的模擬疾病狀態(tài)。AKT為絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶，是PI3K信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中一個重要的下游靶激酶，是重要的抗凋亡調(diào)節(jié)因子，在維持細胞正常生理功能及細胞凋亡方面發(fā)揮重要作用[9]。AKT是強有力的下游底物Bad激酶,活化的AKT可以使Bad的Ser136位點磷酸化,從而阻斷Bad誘導(dǎo)的細胞凋亡，而磷酸化位點Thr308和Ser473可以使AKT激活，從而抑制凋亡，促進增殖[10]。本次實驗中發(fā)現(xiàn)，在海馬及皮層中，模型組小鼠p-AKT-308/AKT、p-AKT-473/AKT比值較正常組顯著降低；AS 可以顯著升高p-AKT-308/AKT、p-AKT-473/AKT。說明AS的神經(jīng)保護作用可能與其對PI3K/AKT信號通路的激活有關(guān)，恢復(fù)了部分凋亡細胞的功能，減少了細胞凋亡的系列反應(yīng)，從而起神經(jīng)保護作用。

AKT的活性變化與核轉(zhuǎn)錄因子NFκB密切相關(guān)，在諸多生物學效應(yīng)中，活化態(tài)的AKT可磷酸化IкB激酶(IкB kinase，IKK)，IKK活化而降解NFκB，而NFκB在執(zhí)行和控制細胞凋亡的過程中發(fā)揮重要作用，它能夠促進促凋亡基因如天冬氨酸特異的半耽氨酸蛋白激酶家族等的表達，從而促進組織細胞凋亡[11]。NFκB是一個由復(fù)雜的多肽亞單位組成的蛋白家族，以各種同源或異源的NFκB/Rel構(gòu)成的一種二聚體蛋白，其中p65/p50異源二聚體發(fā)揮主要作用[12]。NFκB的激活可以使膠質(zhì)細胞中炎癥介質(zhì)產(chǎn)生、自由基生成增多、誘發(fā)細胞凋亡，Aβ的增多和沉積、形成、神經(jīng)元損傷及丟失，所以神經(jīng)細胞中NFκB活化過度是引起神經(jīng)細胞凋亡和包括AD在內(nèi)的退行性病變的主要原因[13]。溫蒲圓[14]研究表明，Aβ通過激活NFκB通路對體外培養(yǎng)神經(jīng)元產(chǎn)生毒害作用，導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡。本次實驗結(jié)果顯示，在海馬及皮層組織中，模型組NFκB p-p65/NFκB p65表達量顯著升高，AS可顯著降低NFκB p-p65/NFκB p65的表達。這說明AS能下調(diào)NFκB的表達，提示AS可能通過抑制NFκB的活性來減少Aβ的毒性作用，發(fā)揮其神經(jīng)保護作用，為后續(xù)實驗提供了一定的依據(jù)，而明確的作用機制，有待于進一步深入研究。