梔子有效部位的潰瘍性結腸炎活性及其化學成分研究

楊 超，劉 婧，鐘 瑞，吳志瑰,2，裴建國，陳 瑤，黃 瀟，高 莎，闞 瑞，付小梅,2

(1．江西中醫(yī)藥大學藥學院，江西 南昌 330004；2．范崔生全國名中醫(yī)傳承工作室,江西 南昌 330006)

伴隨著物質生活的日益改善，不良的生活飲食習慣導致消化系統疾病頻發(fā)，慢性非特異性疾病潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)在國內的發(fā)病率也在逐年升高，UC發(fā)病后將嚴重降低患病者的生活質量，病變蔓延將會危及患者生命。在臨床診斷上，UC主要表現為腹痛伴嚴重腹瀉、大便濃膿伴血便，患者體重明顯減輕、精神萎靡，而且該病情易復發(fā)，治療難度較大[1]。目前，UC的治療藥物主要是柳氮磺胺吡啶水楊酸制劑、皮質類固醇、免疫抑制劑等，由于這些藥物的治療多以緩解癥狀為主，并且存在停藥后易復發(fā)、耐藥性增加或不良反應多等諸多問題，因此尋找新的治療藥物以及治療方法迫在眉睫。中國傳統中藥多為植物源性天然藥物，通常副作用較少，對慢性病療效更佳，所以可能成為UC的重要補充治療手段。

梔子為臨床常用中藥，是茜草科梔子屬植物梔子GardeniajasminoidesEllis的成熟干燥果實，性寒、味苦，具有瀉火除煩、清熱利尿、涼血解毒的功效，現代藥理研究表明梔子及其中主要成分具有較好的抗炎活性[2-3]。本課題組在前期預實驗研究中發(fā)現梔子35%及70%乙醇提取部位均具有較好的抗炎作用，但其對UC的研究卻未見報道。因此本實驗以TNBS誘導的大鼠UC，以梔子35%及70%乙醇提取部位對UC大鼠進行灌胃給藥，并對給藥后的大鼠進行體重測定，疾病活動指數(DAI)評分，觀察給藥前后結腸病理學改變及髓過化物酶 (MPO)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、炎癥因子白細胞介素-6(IL-6)、白細胞介素-1β (IL-1β)變化，以找尋對潰瘍性結腸炎作用的有效部位，同時采用UPLC-ESI-Q-TOF/MS對有效部位中的化學成分進行鑒定研究，明確其活性成分，以期為梔子進一步開發(fā)奠定基礎。

1 材料

1.1 藥物與試劑梔子購自江西省樟樹GAP基地，經江西中醫(yī)藥大學范崔生教授鑒定為梔子GardeniajasminoidesEllis 的干燥果實，憑證標本存于江西中醫(yī)藥大學中藥鑒定學科組。乙腈和甲醇均為質譜級別(德國Merck公司)；TNBS(Sigma aldrich，批號：SLBT1675)；柳氮磺吡啶腸溶片(上海信誼天平藥業(yè)有限公司)；NO檢測試劑盒(批號：S0021)、MDA檢測試劑盒(批號：S0131)、總SOD活性檢測試劑盒(批號：S0109)均購買于上海碧云天生物技術有限公司；髓過氧化物酶(MPO)檢測試劑盒(南京建成生物科技有限公司)；大鼠IL-1β酶聯免疫吸附測定試劑盒(批號：A301B81043)、大鼠IL-6酶聯免疫吸附測定試劑盒(批號：MM-0190R1)、大鼠TNF-α疫吸附測定試劑盒(批號：A38280855)均購買于杭州聯科生物技術股份有限公司；糞便隱血定性檢測試劑盒(鄰聯甲苯胺法)(北京百奧萊博科技有限公司，批號：0311A19)。

1.2 實驗動物SPF 級♂ SD 大鼠，體質量(180±20)g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，動物許可證號 SCXK(湘)2016-0004。實驗動物倫理委員會所屬單位為江西中醫(yī)藥大學，使用許可證號SYXK(贛)2017-0004。

1.3 實驗儀器KZ-Ⅱ高速組織研磨儀(武漢賽維爾生物科技有限公司)，多功能酶標儀(Thermo Fisher Scientific，USA)，Millipore超純水制備器(美國Millipore公司)；KQ-250超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，HH-4型數顯恒溫水浴鍋(國華電器有限公司)，BS224S電子天平(北京賽多利斯有限公司)；Neofuge 13R型高速冷凍離心機(上海力申科學儀器有限公司)；LC-C18SPE固相萃取小柱(上海安譜實驗科技股份有限公司)；超高效液相色譜串聯四級桿飛行時間質譜儀(ABSCIEX Triple TOF 5600+)，配有電噴霧離子源(ESI)、Analyst 1.6 色譜工作站和 PeakView 等質譜分析軟件(AB SCIEX 公司)；Nexera UPLC LC-30A超高效液相色譜儀(日本島津公司)。

2 方法

2.1 梔子樣品制備梔子藥材1 010 g，用8倍量70%乙醇回流提取2次，每次2 h，合并濾液，減壓濃縮至無醇味，得到梔子浸膏共242 g。取梔子浸膏加水成混懸液，上HPD-600大孔樹脂柱，依次用水、35%乙醇、70%乙醇、95%乙醇洗脫，得4個部分洗脫液，濃縮后冷凍干燥，其中35%乙醇洗脫部位(G-35)68.89 g，70%乙醇洗脫部位(G-70)46.62 g。

2.2 動物分組、造模及給藥適應性喂養(yǎng)1周后，將35只SD ♂大鼠隨機分為5組，即對照組、模型組、陽藥(柳氮磺吡啶)組、G-35組，G-70組。采用文獻報道方法[4]制備大鼠UC模型，大鼠禁食24 h后一次性將TNBS/50%乙醇溶液混合溶液(1 ∶1混合)用橡膠輸液管緩慢注入肛門約8 cm處腸腔內，捏緊肛門，倒置數分鐘，造模劑量為50 μL·g-1，對照組注入相同體積生理鹽水。造模后d 2開始給藥，陽性藥柳氮磺吡啶組按200 mg·kg-1劑量給藥，35%乙醇和70%乙醇提取部位組均按生藥量(2.1g·kg-1)給藥，對照組和模型組均予以蒸餾水，以上各組每天給藥1次，共給藥7 d。

2.3 一般體征觀察自建立大鼠UC模型之日起直至灌胃給藥結束，每天觀察各組大鼠狀態(tài)(包括精神、活動以及體毛等)，每天在同一時間稱大鼠質量并記錄，觀察各組大鼠的糞便情況(包括顏色、性狀)，并蘸取糞便通過隱血試劑盒測定有無隱血情況，根據以上指標對大鼠進行疾病活動指數(disease activity index，DAI)評分，參照文獻[5]所描述的評分標準進行評分。

2.4 結腸黏膜組織病理學觀察治療7 d后處死大鼠，取近肛門8 cm處結腸組織后，將其用甲醛固定后，脫水、浸蠟、包埋、切片，HE染色，顯微鏡下觀察結腸病理情況，并參照文獻[6]所描述的評分標準對大鼠結腸潰瘍情況進行評分。

2.5 結腸組織的生化指標測定將各組大鼠結腸組織稱重，根據試劑盒要求制備組織勻漿液，離心后提取上清液，置于-80 ℃凍存。按照試劑盒說明書的步驟測定各組大鼠結腸MPO、NO、SOD、MDA、IL-1β、IL-6、TNF-α水平。

2.7 采用UPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS技術分析活性部位化學成分

2.7.1供試品溶液的制備 藥效最好的洗脫部位的浸膏約0.01 g，加10 mL甲醇超聲溶解，溶液經0.22 μm微孔濾膜過濾，備用。

2.7.2色譜-質譜條件 ACE Excel 1.7 SuperC18 色譜柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)，流動相0.1%甲酸水(A)-乙腈(B)，梯度洗脫(0-10 min，5%-15% B；10-12 min，15%-21% B；12-15 min，21% B；15-18 min，21%-23% B；18-20 min，23%-50% B；20-30 min，50%-95% B)，流速0.3 mL·min-1；進樣量3 μL；柱溫40 ℃。離子源：電噴霧離子源(ESI)，母離子質量掃描范圍：m /z 100-1 000，二級離子碎片質量掃描范圍：m/z 50-1 000，IDA 設置響應值超過 100 cps 的峰優(yōu)先進行二級質譜掃描，開啟動態(tài)背景扣除(DBS)，其它各參數以及參數設置如下：負離子源噴霧電壓為-4500 V，離子源溫度為500 ℃，去簇電壓(DP)-100 V，碰撞能量(CE)為 -45 eV，碰撞能量擴展(CES)為15 eV。霧化氣體為N2，輔助氣1(GS1)為50 PSI，輔助氣2為50 PSI，氣簾氣(CUR)為40 PSI。

3 結果

3.1 大鼠一般體征觀察對照組的大鼠飲水、進食正常，無明顯體質量下降，無腹瀉、便血等異常改變。模型組的大鼠出現飲食減少，出現不同程度的腹瀉、便血、肛門血染等癥狀，體質量下降趨勢高于對照組(P<0.01)，模型組DAI評分明顯高于對照組(P<0.01)。藥物治療后，陽藥組、G-35組以及G-75組飲食飲水狀態(tài)逐漸恢復，大便腹瀉、便血現象逐漸消失，與模型組相比，陽藥組、G-35組以及G-75組的大鼠體質量逐漸恢復(P<0.01)，DAI評分明顯降低(P<0.05，P<0.01)，見Fig 1。

3.2 結腸組織病理學觀察光鏡下觀察各組大鼠結腸組織切片發(fā)現：對照組結腸表面上皮、隱窩、黏膜肌層、黏膜下層和杯狀細胞完整；模型組可見大量上皮破壞，杯狀細胞丟失和隱窩膿腫，大量炎性細胞浸潤、充血；陽藥組和G-35組結腸組織局部損傷，可見部分完整組織結構，炎性細胞浸潤程度減弱，顯微損傷明顯改善，而G-70組腸組織結構損傷較為嚴重，無明顯改善。按病理組織學診斷指標對染色結果進行評分，與對照組相比，模型組病理組織學評分升高(P<0.01)；與模型組相比較，G-35組病理組織學評分顯著性下降(P<0.01)，G-70組與模型組相比差異無顯著性，表明梔子G-35能夠有效改善TNBS誘導的大鼠腸黏膜損傷、炎癥細胞浸潤，G-70對大鼠結腸病理損傷無明顯改善作用，見Fig 2。

Fig 2 The pathological observation on colon tissues of rats in each group(×200)##P<0.01 vs control group;**P<0.01 vs model group

3.3 結腸組織的生化指標變化

3.3.1梔子不同醇提部位對結腸組織中MPO、NO、SOD、MDA的影響 與對照組相比，模型組大鼠結腸組織MPO、NO、MDA水平升高(P<0.01)，SOD水平降低(P<0.01)。與模型組相比，陽藥組、G-35組的MPO、NO、MDA水平降低(P<0.01)，SOD水平升高(P<0.01)。而G-70組與模型組相比，除SOD水平明顯高于模型組外(P<0.05)，其它指標與模型組差異無顯著性，見Fig 3。

3.3.2梔子不同醇提部位對結腸組織中IL-1β、IL-6、TNF-α的影響 與對照組相比，模型組IL-1β、IL-6、TNF-α水平升高(P<0.01)。與模型組相比，陽藥組、G-35組的IL-1β、IL-6、TNF-α水平降低(P<0.01)。而G-70組與模型組相比各項指標差異均無顯著性，見Fig 4。

3.4 質譜信息數據庫的建立與化學成分鑒定采用UPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS對G-35進行化學成分鑒定，通過與對照品比對、保留時間對比、母離子質量數對比、母離子裂解規(guī)律分析、查詢相關文獻信息[7-10]共鑒定出了19個化合物，其總離子流圖見Fig 5，化合物的具體信息見Tab 1，包括化合物名稱、保留時間(TR)、分子式、質量偏差、離子碎片等。

Fig 3 Contents of MPO,NO,SOD and MDA in colon tissues of rats in each group##P<0.01 vs control group;*P<0.05,**P<0.01 vs model group

Fig 4 Contents of IL-1β,IL-6 and TNF-α in colon tissues of rats in each group##P<0.01 vs control group;**P<0.01 vs model group

Fig 5 Total ion current under negative ion mode of 35% ethanol extraction siteTab 1 UPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS analysis of chemical compositions in G-35 under negative ion mode

4 討論

本實驗采用TNBS混合50%乙醇灌腸誘導的UC大鼠模型，該模型在發(fā)病進程、病理表現等方面與人體發(fā)病較為類似，是目前最為常用的潰瘍性結腸炎動物模型[11]。模型組的大鼠在造模后出現腹瀉、稀便、膿血便，活動、進食、體質量均明顯減少，鏡下觀察腸黏膜破損，大量炎性細胞浸潤，潰瘍形成。與對照組相比，DAI和組織學評分升高，表明造模成功。在給予梔子35%醇提部位治療后，結腸炎癥狀減輕，其對應的DAI值和組織學評分優(yōu)于模型組，表明梔子35%醇提部位對TNBS誘導大鼠形成的UC癥狀具有明顯的治療作用。

IDTR/minIdentificationMolecularformulam/z[M-H]-m/z[M+COOH]-CalculatedMeasuredppmMS210.96MonotropeinC16H22O11389.10894389.10828-1.7209,19122.64shanzhisideC16H24O11391.12459391.12384-1.9229,211,193,18533.11gardosideC16H22O10373.11402373.11322-0.6193,14943.21GeniposidicacidC16H22O10373.11402373.11295-2.9373,211,14953.61scandosidemethylesterC17H24O11403.12459403.12336-3241,13963.96gardenosideC17H24O11403.12459403.12363-2.4402,24174.266-alpha-HydroxygeniposideC17H24O11403.12459403.12363-2.4402,241,13985.76ChlorogenicacidC16H18O9353.08781353.08743-1.1191,179,173,13596.63Genipin-1-β-D-gentiobiosideC23H34O15549.18249549.18128-2.2225,207,147,123,101107.21JasminosideIC22H36O12537.21778537.21639-2.6341,167118.01geniposideC17H24O10433.13405433.13376-0.7207,145,75129.32epijasminosideAC16H26O7375.16496375.165331169139.86jasminosideO/TC21H34O11507.20771507.20721-1.2-1411.21zatarosideBC16H24O7373.14931373.149490.5175,165,1311512.8710-O-acetylgeniposideC19H26O11475.14462475.14422-0.8-1613.09Hyperoside/Quercetin3-β-D-glucosideC21H20O12509.09258509.09229-0.6301,2711714.126″-O-p-coumaroyl-genipin-gentiobiosideC32H40O17695.21927695.21849-1.1469,367,353,269,2071816.76crocinIC44H64O24975.37148975.36511-2.2651,327,2831920.36cis-crocin2/trans-crocin2C32H44O14651.26511651.278892.6327,283,239

由于機體的氧化應激失衡與UC的發(fā)病密不可分，過氧化反應作為發(fā)生UC的重要因素，氧自由基水平的升高會激發(fā)炎癥反應，活性氧自由基的產生超過了機體對過氧化物的清除能力就會導致機體的氧化系統及抗氧化系統失去平衡，過多的活性氧自由基會導致脂質過氧化、蛋白質變性及誘發(fā)基因突變，最終導致細胞的氧化損傷[12-13]。酶抗氧化防御體系和脂質過氧化是反應氧化應激的經典指標，SOD作為酶抗氧化防御體統中主要抗氧化酶，MDA作為脂質過氧化的主要產物，而在UC結腸組織中，SOD活性往往下降，MDA含量升高。本研究結果顯示梔子35%醇提部位能提高SOD活性，降低MDA含量，表明該部位改善結腸損傷的原因可能與其抗氧化作用有一定聯系。

過量的NO產生會導致結腸黏膜損傷，并與結腸炎的發(fā)病機制有關，因此NO可作為炎癥性腸病的重要生物標志物。中性粒細胞浸潤炎癥黏膜是炎癥性腸病最突出的組織學表現之一，MPO活性作為中性粒細胞浸潤的一個重要生物標志物，其常在臨床和實驗研究中作為評價結腸炎癥的程度的指標[14]。在UC的病理發(fā)展中，促炎細胞因子如NF-α、IL-6和IL-1β同樣也起到重要作用[15-16]，TNF-α作為一種多效細胞因子，可誘導廣泛的生理和致病現象，如細胞增殖、分化、死亡、基因轉錄和炎癥的調節(jié)；IL-1β可通過促進血管因子生成發(fā)揮抗皮質素作用，使內皮細胞存活、增殖和產生基質金屬蛋白酶；IL-6可在UC和CD的炎癥樣本中被檢測到，其水平與腸道炎癥程度相關。在本研究中，TNBS誘導的大鼠結腸MPO、NO、IL-6、TNF-α及IL-1β水平升高，提示腸黏膜出現炎癥反應，梔子35%醇提部位能降低組織MPO、NO、IL-6、TNF-α及IL-1β水平，表明該部位對TNBS誘導的UC起保護作用可能是通過抑制中性粒細胞浸潤作用，抑制炎癥因子釋放，從而起到限制炎癥的發(fā)生和發(fā)展作用。

為了進一步確定梔子35%乙醇洗脫部位的成分，明確治療UC的物質基礎，本實驗采用UPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS技術對該部分進行了分析鑒定。通過一級質譜提供的分子量和二級質譜給出的碎片信息，結合文獻數據對于該部分進行鑒定，共鑒定出19個化合物，主要包括環(huán)烯醚萜及其苷類成分、有機酸類、黃酮類、西紅花苷類等成分，其中化合物8(綠原酸)和化合物11(京尼平苷)均已被證明具有治療UC的作用[17-18]。而該部位中其它單體成分是否具有治療作用，成分與成分之間是否有相互作用，成分是否通過抗氧化及抗炎的共同作用將進一步深入研究。