網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)挖掘丹參-苦參藥對提取物的抗炎藥效及分子機制研究

成 鵬，黃 帥，楊 宇，吳佳偉，陳文星，王愛云，陸 茵

(南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇省中藥藥效與安全性評價重點實驗室，江蘇 南京 210023)

炎癥反應(yīng)是機體抵御外界刺激的重要過程，其中多種促炎細胞因子是炎癥反應(yīng)發(fā)生發(fā)展的最重要參與者。心血管疾病的病因與炎癥有密不可分的關(guān)系，如動脈粥樣硬化。炎癥出現(xiàn)在動脈粥樣硬化的每個階段——從疾病的發(fā)生發(fā)展到并發(fā)癥：導(dǎo)致斑塊破裂和重要器官的血流量的減少。炎癥主要影響幾種細胞的功能，比如特定于血管壁的細胞(如內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞)及響應(yīng)特定刺激而募集到血管壁的細胞(如免疫細胞和血小板)[1]。

丹參SalviamiltiorrhizaBge.是唇形科鼠尾草植物丹參的干燥根及根莖[2]，其提取物中主要含有脂溶性二萜類和水溶性酚酸類成分，主要藥理作用為降血脂，抗炎，改善微循環(huán)和抗腫瘤等[3-5]。苦參Kushencens Ait.為豆科槐屬植物苦參的干燥根莖，其活性成分主要為生物堿類和黃酮類，具有抗菌和抗炎作用，并且對心血管系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)相關(guān)疾病都有不同程度的改善及治療作用[6]。臨床上丹參和苦參藥對配伍已廣泛應(yīng)用到心血管疾病，慢性肝炎，以及腫瘤免疫治療中[7-9]，然而藥對配伍中的主要活性成分發(fā)揮具體藥效的機制尚不明確。

中醫(yī)藥有豐富的臨床經(jīng)驗，在治療心血管及炎癥相關(guān)疾病顯示出良好的效果。然而中藥復(fù)方的多成分、多靶點特征，使中醫(yī)藥現(xiàn)代化發(fā)展道路艱難重重。而網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的逐步完善，生物信息學(xué)、系統(tǒng)生物學(xué)和計算生物學(xué)等學(xué)科的融合，“成分-靶點-疾病”多層次網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，都便于我們從整理到局部，有邏輯有層次的研究藥物與疾病的關(guān)聯(lián)，進而預(yù)測藥物的靶點，探索藥物作用機制。

本研究首先利用中草藥系統(tǒng)藥理學(xué)平臺(TCMSP)和上海有機所中藥天然產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫尋找丹參苦參藥對的主要活性成分，并使用STITCH和TCMSP數(shù)據(jù)庫對其靶點進行預(yù)測，隨后借助DAVID及g:Profiler數(shù)據(jù)庫對其進行通路富集分析，發(fā)現(xiàn)結(jié)果顯示，丹參-苦參提取物作用機制與免疫過程中促炎因子及血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)通路相關(guān)。最后利用二甲苯致小鼠耳腫脹模型以及炎性因子滲出模型評價藥效。并且從降低促炎細胞因子水平，減少促炎細胞因子滲漏兩方面驗證丹參苦參藥對的抗炎作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物ICR小鼠，122只，體質(zhì)量(18-22) g，雌性，購自浙江省實驗動物中心，合格證編號：No.201512683。72只ICR小鼠用于炎性耳腫脹實驗和細胞因子檢測，50只ICR小鼠用于炎癥滲出實驗。

1.2 藥品與試劑丹參、苦參均購自安徽省毫州市中醫(yī)藥有限公司，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院劉圣金副教授鑒定均為正品。丹參、苦參按照3 ∶1碾碎成細粉，按照M ∶V=1 ∶10的比例加水提取，經(jīng)濃縮、減壓干燥后得干膏粉備用，每1 g干膏等于5.102 g生藥量；酞丁安(北京協(xié)和藥廠，141002)；伊文思藍(BIOSHARP，Ameresco E2129)；脫毛膏(加拿大奈爾Nair公司男士專用脫毛膏，Cat.No.MZ-5)；Mlliplex MAP Mouse Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel.Cat#：MCYTPMAG-70K，Kit Lot#：2761476；二甲苯(永華化學(xué)科技有限公司,Lot.20141220)

1.3 實驗儀器電子天平：賽多利斯有限公司；注射器；高速冷凍離心機：eppendorf centrifuge 5417R；酶標(biāo)儀：Thermo Scientific Multiskan GO；GJ28402熱板測痛儀(浙江寧海白石電子醫(yī)藥儀器廠)；美國Millipore，Luminex 100。

1.4 方法

1.4.1網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測丹參-苦參提取物的抗炎機制 藥對包括丹參和苦參，通過檢索查詢上海有機所中藥天然產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫(http://www.organchem.csdb.cn/)、TCMSP(http:/lsp.nwu.edu.cn/)收集成分，為了篩選活性成分，我們測試了成分的ADME特性(吸收Absorption、分布Distribution、代謝Metabolism和排泄Excretion)，包括口服生物利用度(OB)，藥物相似性(DL)，Caco-2滲透性(Caco-2)，血腦屏障(BBB)和藥物半衰期(HL)使用OB%≥30%，DL≥0.18，Caco-2≥-0.4，BBB≥-0.3和HL≥4的標(biāo)準(zhǔn)進行篩選。

通過STITCH(http://stitch.embl.de/)和TCMSP(http://lsp.nwu.edu.cn/)中虛擬對比結(jié)果，預(yù)測丹參-苦參藥對中活性成分的靶標(biāo)集。在標(biāo)靶集中，采用隨機森林(Random Forest)和支持向量機(Support Vector Machine)于計算機中有效地大規(guī)模整合化學(xué)、基因組和藥理學(xué)信息，以進行大規(guī)模藥物靶向。確定藥物靶標(biāo)時，選取向量機大于0.7或隨機森林>0.8的蛋白是潛在靶標(biāo)。通過Uniprot(http://www.uniprot.org/)數(shù)據(jù)庫，將靶標(biāo)蛋白名轉(zhuǎn)換成基因名(均為人源靶點)。使用Cytpscape3.2.1軟件繪制丹參-苦參藥對-靶點圖。

繼續(xù)通過TTD(https://db.idrblab.org/ttd/)，PharmGkb(https://www.pharmgkb.org/)等數(shù)據(jù)庫，以“inflammation”疾病名為關(guān)鍵詞進行檢索，得到相關(guān)疾病靶點，轉(zhuǎn)換成基因名。

利用Cytpscape3.2.1軟件中插件BisoGenet將上述得到的有效成分靶點及疾病靶點進行蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)的拓撲分析，分別得到兩個網(wǎng)絡(luò)，取兩者交集。繼續(xù)使用Cytpscape3.2.1軟件中Network Analyzer和CytoNCA進行分析，通過分析取度值(degree)、介數(shù)(betweenness centrality，BC)等篩選核心靶點。

篩選核心靶點后，利用DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)及g:Profiler(https://biit.cs.ut.ee/gprofiler/gost)數(shù)據(jù)庫，對篩選的核心靶點進行基因本體(geneontology，GO)分類富集分析及KEGG通路富集分析，并進行可視化結(jié)果處理。分析所得到的結(jié)果，設(shè)計相關(guān)實驗加以驗證。

1.4.2實驗分組與給藥方案 將小鼠隨機分成對照組，丹參-苦參提取物劑量組(2.5、5、10 mg·kg-1)及酞丁安藥物組。

優(yōu)秀的建筑設(shè)計方案可以在保證房屋結(jié)構(gòu)具有實際使用價值的同時，大幅度提高建筑物的環(huán)保價值和經(jīng)濟效益。因此，優(yōu)秀的建筑結(jié)構(gòu)設(shè)計方案不僅可以最大限度地節(jié)約建筑成本，還可以給建設(shè)方帶來巨大的經(jīng)濟效益，并且不會破壞周圍環(huán)境，在一定程度上與當(dāng)?shù)氐纳鷳B(tài)環(huán)境相融合，實現(xiàn)經(jīng)濟效益與自然環(huán)境的可持續(xù)發(fā)展。由此看來，科學(xué)合理地對建筑進行結(jié)構(gòu)優(yōu)化設(shè)計有利于體現(xiàn)建筑的綜合價值。

給藥方案：每只動物外部受試部位涂抹給藥1 cm，連續(xù)給藥7 d。空白組涂抹0.9 μL 75%乙醇，實驗組涂抹0.9 μL含丹參-苦參提取物的75%乙醇溶液，酞丁安藥物組涂抹0.1 g·10 g-1。

1.4.3小鼠炎性腫脹模型 將60只ICR小鼠分別隨機分成5組(n=12)，給藥前24 h使用脫毛膏對腹部進行脫毛處理，脫毛面積為2 cm×2 cm，給藥方式見“1.4.1”。末次給藥后30 min，將30 μL二甲苯(2%)涂在小鼠右耳處,左耳作對照,致炎處理1 h后，小鼠進行眼眶取血，并脫頸處死，并剪下雙耳片用8 mm打孔器分別在耳同一部位鉆取兩耳圓片用電子天平稱重[10]。

1.4.4液相芯片檢測小鼠血清中細胞因子的分泌 血清獲取：對耳腫脹模型小鼠以及剩余空白小鼠(n=12)進行眼眶取血，并脫頸處死。將全血于室溫靜置3-4 h至血清分層，隨即1 000g離心10 min，吸取上層血清分裝，每管30 μL。

血清樣品檢測前準(zhǔn)備：-80 ℃冰箱取出，室溫融化。按照Mlliplex MAP Mouse Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel 說明書進行檢測，所檢測炎性因子包括IL-4(白細胞介素-4)、IFN-γ(干擾素γ)、IL-12(白細胞介素-12)、IL-6(白細胞介素-6)、TNF-α(腫瘤壞死因子α)、CXCL-1(趨化因子-1)、G-CSF(粒細胞集落刺激因子)、IL-10(白細胞介素-10)[11-12]。

1.4.5小鼠腹腔毛細血管通透性實驗 將50只ICR小鼠分別隨機分成5組(n=10)。給藥前24 h用脫毛膏對小鼠腹部進行脫毛處理,脫毛面積為2 cm×2 cm。于末次給藥后30 min，以0.1 mL·10 g-1對所有小鼠尾靜脈注射0.5%伊文思藍氯化鈉溶液，隨后在小鼠腹部去毛皮膚上滴加二甲苯(2%)0.05 mL。20 min后脫頸處死小鼠，剝下腹部脫毛處的蘭染皮膚，用直徑1.5 cm打孔器打下蘭染皮膚圓片，并投入裝有5 mL丙酮-100 mL生理鹽水溶液(帶塞)試管內(nèi)，密封置暗處，每天輕輕搖動試管2-3次。3 d后1 000轉(zhuǎn)離心5 min,吸上清液用分光光度計在630 nm處測吸光度(A)值，用A值衡量動物腹腔滲出液的伊文思藍染料的含量，作為檢測毛細血管通透性的指標(biāo)[13]。

2 結(jié)果

2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析揭示丹參-苦參提取物的作用機制與促炎因子分泌及外滲相關(guān)通過檢索查詢上海有機所中藥天然產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫、TCMSP數(shù)據(jù)庫查找檢索丹參-苦參藥對中成分，發(fā)現(xiàn)丹參中包含202個成分，苦參中成分為113個。經(jīng)ADME特性篩選后，丹參活性成分為38個，苦參為33個。通過STITCH和TCMSP數(shù)據(jù)庫預(yù)測丹參、苦參潛在靶點。刪除重復(fù)項后，發(fā)現(xiàn)丹參活性成分靶點為70個，主要為丹參酮類化合物和酚酸類化合物，苦參為110個，主要為生物堿類化合物。隨后利用Cytpscape 3.2.1軟件繪制丹參-苦參藥對成分靶點網(wǎng)絡(luò)圖。

將丹參-苦參藥對靶點及炎癥靶點分別通過BisoGenet插件進行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(protein-protein interaction network，PPI)的拓撲分析。得到丹參-苦參藥對潛在靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)，包括4 748個節(jié)點；炎癥潛在靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)，包括902個節(jié)點。將兩者網(wǎng)絡(luò)進行交集(Merge)，得到交集網(wǎng)絡(luò)，并使用CytoNCA插件分析，取得770個節(jié)點。取Degree值大于58的基因作為核心靶點，得到腫瘤壞死因子(TNF)，絲裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)，NFKB1，信號傳導(dǎo)與活化轉(zhuǎn)錄因子3(STAT3)等基因。這些蛋白與炎癥密切相關(guān)，說明丹參-苦參藥對可能通過這些蛋白發(fā)揮抗炎作用。

DAVID中的GO分析顯示，丹參-苦參藥對預(yù)測的核心靶點在生物學(xué)過程中靠前的有腫瘤壞死因子，NF-κB信號通路和免疫相關(guān)過程的調(diào)控等，說明丹參-苦參藥對可能針對這些途徑發(fā)揮抗炎作用；在分子功能中排名靠前的有ATP的結(jié)合，轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合和細胞與細胞的黏附等。隨后進行KEGG通路分析，選取P值相對較小且基因富集的20條通路，主要有：TNF信號通路，免疫相關(guān)通路，VEGF信號通路和趨化因子信號通路等。說明丹參-苦參藥對發(fā)揮抗炎作用的機制與免疫相關(guān)過程和VEGF信號通路相關(guān)。

使用g:Profiler(https://biit.cs.ut.ee/gprofiler/gost)數(shù)據(jù)對核心靶點同樣進行GO分析及KEGG分析，同時補充Reactome和WikiPathways分析，分析結(jié)果與DAVID數(shù)據(jù)庫基本一致，兩者結(jié)果相互佐證。

隨后設(shè)計實驗確定丹參-苦參藥對的抗炎藥效，并以預(yù)測的炎癥相關(guān)靶點如STAT3通路，VEGF通路和免疫過程中的促炎因子開展實驗。

2.2 丹參-苦參提取物對炎性腫脹的影響實驗結(jié)果結(jié)果如Tab 1以及Fig 3所示，與對照組相比，丹參-苦參提取物10 g·L-1的濃度下可明顯抑制二甲苯所致的小鼠耳腫脹(P<0.05)。

Fig 1 Construction of core target network

Fig 2 Analysis of biological process,molecular function and KEGGpathway enrichment

Tab 1 Effect of SK on inflammation

Fig 3 Effect of SK on inflammation of mouse ear edema

2.3 丹參-苦參提取物對小鼠外周血清細胞因子分泌的影響實驗結(jié)果利用luminex液相芯片檢測技術(shù)，研究丹參-苦參提取物對促炎細胞因子IFN-γ、IL-4、IL-6、IL-12、CXCL-1、TNF-α、IL-10、G-CSF表達水平的影響進行分析，結(jié)果如Tab 2所示，丹參-苦參提取物對外周血清中IL-12、IL-4、TNF-α、IFN-γ、IL-10、CXCL-1的表達無明顯作用，而在2.5 g·L-1濃度下IL-6的表達受到了明顯的抑制，5 g·L-1濃度下抑制效率達到最高，10 g·L-1的抑制效率有所下降，但仍然呈現(xiàn)顯著性抑制效應(yīng)。同時丹參-苦參提取物在5、10 g·L-1濃度下明顯抑制G-CSF的分泌。結(jié)果顯示，丹參-苦參提取物的抗炎作用可能與抑制IL-6和G-CSF的分泌相關(guān)。

Tab 2 Effect of SK on expression of different inflammatory cytokines in peripheral

2.4 丹參-苦參提取物對炎癥滲出的影響實驗結(jié)果與對照組相比，丹參-苦參提取物在5 g·L-1的濃度下對二甲苯所致的小鼠腹部毛細血管通透性增加產(chǎn)生明顯抑制(P<0.05)，結(jié)果如Tab 3和Fig 4所示。

Fig 4 Effect of SK on capillary permeability in mice

Tab 3 Effect of SK on capillary permeability

3 討論

中藥復(fù)方配伍是中醫(yī)藥文化的精髓，而藥對配伍則是復(fù)方的核心[14-15]。丹參是活血化瘀藥的典型代表藥物，臨床上被廣泛用于心腦血管系統(tǒng)等疾病的治療。苦參在臨床上則主要用來消炎、抑菌以及腫瘤的聯(lián)合治療，并且有相關(guān)文獻表明苦參的有效成分，如苦參堿和氧化苦參堿等，丹參中丹酚酸IIA等具有明顯的抗炎功效[16]。丹參苦參配對，可發(fā)揮明顯抗炎功效。本實驗結(jié)果顯示，10 g·L-1丹參-苦參提取物能明顯減少小鼠耳腫脹模型的腫脹系數(shù)，升高急性熱刺激引發(fā)的疼痛閾值。此外，西藥受試藥物酞丁安，也發(fā)現(xiàn)具有明顯抗炎鎮(zhèn)痛作用。

促炎細胞因子主要是由免疫細胞分泌的內(nèi)源性多肽，是炎癥反應(yīng)的主要參與者[17]，其中IL-6可以在慢性炎癥中通過調(diào)控T淋巴細胞的分化和激活，維持調(diào)節(jié)性T細胞核輔助性T細胞間的平衡而發(fā)揮重要作用[18]。丹參-苦參藥對核心靶點GO分析與通路分析顯示，其發(fā)揮藥效的途徑與免疫過程中細胞因子調(diào)控相關(guān)。在本研究結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，5 g·L-1和10 g·L-1的濃度下丹參-苦參提取物能明顯降低G-CSF和IL-6的水平，從而發(fā)揮與酞丁安類似的抗炎作用。

此外，從結(jié)果上來看，二甲苯刺激產(chǎn)生的急性炎癥反應(yīng)并未明顯改變細胞因子IFN-γ、IL-4、CXCL-1、IL-10、IL-12P70、TNF-α的水平,且受試藥物也不能改變其基礎(chǔ)水平。而藥物對于IL-6,G-CSF的具體作用機制，是通過抑制STAT3通路中何種環(huán)節(jié)還需進一步研究。除此之外，在5和10 g·L-1的濃度下，丹參苦參提取物能夠明顯降低炎性組織毛細血管的通透性，減少炎性滲出，進而減少組織的炎性損傷，這與抑制VEGF水平相關(guān)。符合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測。

最后，通過文獻調(diào)研發(fā)現(xiàn)，丹參中丹參酮不僅能抑制STAT3通路，還可以抑制VEGF通路；同樣，苦參中苦參堿及氧化苦參堿均可抑制STAT3通路和VEGF通路。本文基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測潛丹參苦參藥對發(fā)揮抗炎藥效與STAT3通路和VEGF通路相關(guān)，而其中丹參酮、苦參堿和氧化苦參堿等可能是發(fā)揮藥效的主要成分。這為我們接下來研究指明了道路，本文后續(xù)將基于STAT3通路和VEGF通路，以丹參苦參藥對中主要成分丹參酮、苦參堿和氧化苦參堿為代表，研究其配伍比例，進一步研究丹參-苦參提取物發(fā)揮抗炎作用的具體機制。