參草通脈顆粒對慢性心衰大鼠Wnt信號通路配體表達的影響

劉曉蕾，張艷，禮海，王懿

（1.沈陽市第二中醫(yī)醫(yī)院醫(yī)務(wù)科，遼寧 沈陽 110101；2.遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院專家門診，遼寧 沈陽 110032）

慢性心力衰竭（CHF）是以舒縮功能障礙為主的嚴重臨床綜合征，是多種疾病終末期表現(xiàn)。臨床治療多以常規(guī)西藥為主，重度及頑固性心衰采用心臟再同步治療、心臟移植等非藥物療法，但上述療法不良反應(yīng)多且價格昂貴、應(yīng)用受限。參草通脈顆粒是臨床治療CHF 的經(jīng)驗方，王辰等[1]前期對280 例CHF 患者通過多中心隨機雙盲平行實驗，發(fā)現(xiàn)參草通脈顆粒對CHF 患者具有良好療效。本研究應(yīng)用ELISA 法（酶聯(lián)免疫法），通過經(jīng)典和非經(jīng)典Wnt傳導通路，分析參草通脈顆粒治療CHF的療效機制，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取體質(zhì)量為300～350 g，15 周齡，SPF 級SD雄性大鼠90只，由遼寧中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供。

1.2 藥物制備 賴諾普利片（上海信誼萬象藥業(yè)股份有限公司,批號：20131015，規(guī)格：10 mg）。參草通脈顆粒藥方組成：丹參、人參、黃芪、紅花、三七粉、益母草、茯苓、葶藶子（本溪三藥有限公司，批號：遼藥制Z0901013）。

1.3 實驗試劑和儀器 Wnt3a、Wnt5a、Wnt11 蛋白測定的ELISA試劑盒，低溫高速離心機，酶標儀等。

1.4 慢性心衰大鼠動物模型制備 大鼠正常條件下適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，為全部動物編號后隨機抽取20只為正常組。其余大鼠禁食不禁水12 h后，腹腔麻醉，氣管插管，消毒后在左側(cè)第3、4肋間橫向切開長約1～2 cm，逐層分離，暴露視野可見心臟，用縫合線結(jié)扎距離左冠脈前降支起始點2～3 mm處，心電圖提示胸導ST段和T波出現(xiàn)明顯異常，說明結(jié)扎成功，將心臟送回胸腔，用注射用青霉素鈉（哈藥集團制藥總廠，國藥準字H23021439）手術(shù)切口處敷用，大鼠生命體征平穩(wěn)后，撤掉呼吸機。預防術(shù)后感染，連續(xù)3 d應(yīng)用注射青霉素鈉30萬IU，每天1次。正常飼養(yǎng)1周后，喂養(yǎng)飼料減少1/2；同時，大鼠每天1次力竭式游泳，連續(xù)4周。經(jīng)超聲檢測左室射血分數(shù)（LVEF）≤60%，可判定為心力衰竭[2]。

1.5 實驗分組與給藥 大鼠在造模前后共死亡11只，將剩余59只大鼠，按照隨機數(shù)字表法分為模型組（n=19）、參草通脈顆粒組（n=20）、賴諾普利組（n=20），空白對照組為正常喂養(yǎng)未手術(shù)造模大鼠（正常組）。正常組和模型組大鼠不用藥，灌胃0.9%氯化鈉溶液10 mL/kg，每天1次。其余組大鼠用藥劑量，按人鼠劑量換算公式，藥品劑量（人口服）（g）×0.018/動物體質(zhì)量（kg）＝劑量（g/kg）[3]，計算出賴諾普利組：1.5 mg生藥/kg/d，參草通脈顆粒組：9.2 g 生藥/kg/d，兩組藥溶于3 mL蒸餾水每天灌胃1次，各組連續(xù)給藥42 d。

1.6 實驗取材 大鼠麻醉、處死，腹主動脈取血，常規(guī)離心，收集上清液，分裝后低溫保存，用于檢測Wnt3a、Wnt5a、Wnt11蛋白濃度。

1.7 酶聯(lián)免疫法 按照試劑盒及儀器要求的操作步驟進行。

1.8 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以“”表示，比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清Wnt3a、Wnt5a、Wnt11蛋白水平比較 與正常組比較，模型組大鼠血清中Wnt3a、Wnt5a、Wnt11蛋白水平明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，參草通脈顆粒組和賴諾普利組大鼠血清中Wnt3a、Wnt5a、Wnt11 蛋白水平明顯升高（P＜0.01）；與賴諾普利組比較，參草通脈顆粒組大鼠血清中Wnt3a、Wnt5a、Wnt11 蛋白水平明顯升高（P＜0.01），見表1。

表1 各組大鼠血清Wnt3a、Wnt5a、Wnt11蛋白水平比較(，μg/L)Table 1 The protein expression level of Wnt3a,Wnt5a and Wnt11 in the serumof rat in each group(,μg/L)

表1 各組大鼠血清Wnt3a、Wnt5a、Wnt11蛋白水平比較(，μg/L)Table 1 The protein expression level of Wnt3a,Wnt5a and Wnt11 in the serumof rat in each group(,μg/L)

注：與正常組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.01；與賴諾普利組比較，cP＜0.01

檢測項目Wnt3a Wnt5a Wnt11參草通脈顆粒組（n=20）9.51±0.12bc 19.15±0.17bc 7.37±0.21bc正常組（n=20）15.28±0.69 32.18±1.02 12.58±0.63模型組（n=19）5.29±0.33a 10.97±0.64a 4.31±0.15a賴諾普利組（n=20）8.12±0.11b 16.36±0.71b 6.41±0.12b

3 討論

Wnt 信號通路在CHF 發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，包括經(jīng)典Wnt 通路和非經(jīng)典Wnt 通路。Wnt 蛋白分為Wnt-1 族和Wnt-5a 族，Wnt3a 是Wnt 蛋白家族成員之一,是非常重要的Wnt 配體，與經(jīng)典通路有關(guān)，Wnt5a、Wnt11 配體是Wnt-5a族中的主要成員，與非經(jīng)典通路密切相關(guān)[4]。在慢性心衰過程中，研究發(fā)現(xiàn)Wnt3a 與FZD 和LRP5/6 受體結(jié)合，并激活經(jīng)典的Wnt-Dvl-β-catenin信號通路，促進心肌肥大效應(yīng)[5-6]。Wnt5a 和Wnt11 介導Wnt 非經(jīng)典信號通路，分別激活Wnt/PCP/JNK通路和Wnt/Ca2+信號通路，誘導心肌肥厚[7]。另一項研究結(jié)果顯示，在心肌肥大小鼠模型中，經(jīng)典與非經(jīng)典Wnt信號通路均被激活，Wnt3a和Wnt5a配體表達水平均上調(diào)[8]。因此，經(jīng)典Wnt通路和非經(jīng)典Wnt通路在CHF中起重要作用。

參草通脈顆粒是經(jīng)過長期臨床實踐治療CHF的經(jīng)驗方，療效確切，試驗結(jié)果證明參草通脈顆?？擅黠@改善患者心功能分級，提高LVEF[1]。藥理學研究表明，黃芪可改善心肌舒縮功能、抑制纖維化[9]；人參可降低心肌膠原含量，減少心肌纖維化程度，延緩心室重構(gòu)[10-11]；紅花具有興奮心臟作用，增加冠狀動脈血流量，改善心肌缺血[12]；丹參可抑制Ca2+內(nèi)流，阻止心肌肥厚信號傳導[13]；益母草對心肌肥厚具有一定的抑制作用[14]；三七可提高Na+-K+-ATP 酶和Ca2+-ATP 酶活性,改善離子轉(zhuǎn)運,抑制心肌膠原增生[15]；葶藶子和茯苓均可利尿消腫[16-17]。

本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠血清中Wnt3a、Wnt5a、Wnt11蛋白水平較正常組明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），可能與機體對CHF的發(fā)生產(chǎn)生的負反饋現(xiàn)象有關(guān)，提示經(jīng)典Wnt通路和非經(jīng)典Wnt通路均可促進CHF的病理機制的發(fā)生。經(jīng)藥物干預后，參草通脈顆粒組和賴諾普利組大鼠血清中Wnt3a、Wnt5a、Wnt11蛋白水平明顯升高，與模型組比較差異均有統(tǒng)計學意義，參草通脈顆粒組效果均優(yōu)于賴諾普利組。

綜上所述，參草通脈顆粒通過調(diào)控經(jīng)典Wnt通路和非經(jīng)典Wnt通路，治療慢性心衰療效顯著，值得臨床推廣應(yīng)用。