藏豬和大約克豬ACADM基因表達量與脂肪沉積性狀的相關性分析

唐可人，李盼，段夢琪，張健，張芳芳，王珍梅，董世雄，強巴央宗，商鵬*

(1. 西藏農牧學院動物科學學院，西藏 林芝 860000；2. 黑龍江省大慶市杜爾伯特蒙古族自治縣一心鄉畜牧水產中心，黑龍江 大慶 163000)

脂肪不僅作為動物機體重要的能量來源之一，同時在畜禽肉產品中與瘦肉率和肉品質具有密切聯系。通常情況下，動物脂肪合成和代謝是脂肪沉積的一種平衡狀態，脂肪沉積的增加或減少會影響肉品質[1]。因此，豬脂肪沉積能力已成為影響豬肉品質最關鍵因素[2]。動物機體脂肪沉積與代謝受多基因調控，目前已經報道的與脂肪沉積和代謝的基因主要包括脂肪細胞決定和分化因子1(ADD1)、脂肪和肥胖相關基因(FTO)、脂肪酸合成相關酶、脂肪酸分解相關酶等[3]。本研究團隊前期對藏豬和大約克豬肌肉組織進行了轉錄組學(RNA-seq測序技術)和蛋白質組學(isobaric tags for relative and absolute quantifi-cation, iTRAQ蛋白質譜技術)的聯合分析，確定了中鏈酰基輔酶A脫氫酶(acyl-CoA dehydrogenase，ACADM)為脂肪沉積性狀關鍵差異表達基因[4]。

ACADM是4個酰基輔酶A脫氫酶(ACAD)之一，由9種已知蛋白質組成，主要參與催化中鏈脂肪酸的β-氧化[5]。ACADM基因位于SSC6上的QTL區間，因此它可能是一個與肥胖和生長性狀相關的重要候選基因[6]，該基因的缺乏會引起機體分解中鏈脂肪酸能力下降和肝功能異常，甚至會導致動物死亡[7]。Mitsuyoshi等[8]通過對從74例非酒精性脂肪性肝病活檢標本的ACADM基因轉錄水平定量分析，發現患者的表達水平顯著高于對照組，且隨病情發展顯著降低，這與該基因的脂肪變性和脂肪沉積有關。因此，本試驗以脂肪型豬種(藏豬)和瘦肉型豬種(大約克豬)為研究對象，對ACADM基因起始密碼子上游1 kb區域進行了多態性分析；并采用RT-qPCR技術檢測ACADM基因在肝臟、背脂、背最長肌和心臟組織中的表達差異，聯合其背膘厚和背最長肌組織中肌內脂肪含量進行相關性分析，旨在初步探究ACADM基因對豬脂肪沉積性狀的影響，以期為開發脂肪沉積性狀有效遺傳標記及育種工作提供一定的思路和參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗以藏豬和大約克豬為研究對象，藏豬來源于西藏農牧學院教學實習牧場，大約克豬來源于林芝市銀豐農牧科技有限公司養殖場。共采集118份藏豬和大約克豬耳組織(藏豬58頭，大約克豬60頭)，置于75%酒精中，-20 ℃冰箱保存，用于DNA提取。隨機挑選180日齡藏豬和大約克豬各10頭，無親緣關系，相同的日糧水平，自由采食的模式飼養。屠宰后，按照文獻[9]三點法測定背膘厚；采集肝臟、背脂、心臟和背最長肌組織，液氮速凍，-80 ℃保存，用于RNA提取。

1.2 DNA、RNA提取及cDNA制備

采用苯酚-氯仿法從耳組織中提取總DNA，將其溶解在RNase-Free ddH2O中，-20 ℃保存備用。利用RNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司，DP171221)提取總RNA；采用一步法cDNA反轉錄試劑盒(北京天根生化科技有限公司，KR180123)對總RNA進行反轉錄，將所得合格的cDNA保存于-20 ℃備用。

1.3 單核苷酸多態性(SNPs)篩選與基因分型引物設計

下載GenBank中豬ACADM(登錄號NC_010448.4)基因起始密碼子上游1 kb區域DNA序列，利用Primer Premier 5.0軟件設計引物(表1)，由上海生工生物工程有限公司合成，TE緩沖液溶解，4 ℃保存。

表1 ACADM基因5′側翼區引物信息

1.4 RT-qPCR引物設計

下載GenBank中豬的ACADM(登錄號XM_003359209.1)mRNA序列，以RNF7(登錄號NM_001245011.1)為內參基因[10]，采用Primer Premier 5.0軟件設計引物(表2)，由上海生工生物工程有限公司合成，TE緩沖液溶解，4 ℃保存。

表2 ACADM基因和RNF7基因實時熒光定量引物信息

1.5 基因型頻率與等位基因頻率檢測

采用Sanger測序法對ACADM基因起始密碼子上游1 kb區域DNA序列進行混池測序檢測，每個品種各10頭，用Chromas Pro和DNAMAN 6.0軟件進行序列比對分析，篩選SNPs位點后，擴大樣本進行個體測序，測序工作由上海生工生物工程有限公司完成，統計基因型頻率與等位基因頻率。分別對ACADM基因2個突變位點進行轉錄因子預測，轉錄因子結合位點在http://jaspar.binf.ku.dk/網站上進行搜索。

1.6 RT-qPCR分析

以cDNA為模板，對ACADM和RNF7基因利用Eppendorf Mastercycler PCR儀進行擴增，每個樣品點設置3個重復。20 μL反應體系，包括SYBR Green Mix(北京天根生化科技有限公司，FP171206)10 μL，上、下游引物(10 μmol /L)各1 μL，RNase-free water 7 μL，cDNA模板1 μL。熒光定量PCR擴增程序為：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，80 ℃檢測熒光，共38個循環。樣品mRNA的相對表達量使用2-ΔΔCt法[11]進行計算。

1.7 肌內脂肪含量測定

采用傳統索氏抽提法測定肌內脂肪含量，參照文獻[12]，最后計算每個樣品的肌內脂肪含量值。

1.8 統計與分析

利用SPSS 18.0軟件分別對ACADM基因表達量進行雙因素(品種和組織)分析以及背膘厚、ACADM基因背最長肌表達量與肌內脂肪含量的相關性(Pearson相關系數)分析，使用Pearson chi-square對ACADM基因的基因型頻率和等位基因頻率進行顯著性檢驗，測定結果以“平均值±標準誤”表示。

2 結果與分析

2.1 SNPs篩選

在ACADM基因起始密碼子上游1 kb區域共發現2個多態性位點(圖1a、圖1b)，分別在起始密碼子上游101和569 bp位置發現C/G突變，記為C-101G(圖1a)和C-569G(圖1b)。

a.C-101G位點； b.C-569G位點

2.2 ACADM基因多態性位點基因型頻率和等位基因頻率分布分析

由表3可知，在品種內，C-101G和C-569G的基因型分布在藏豬和大約克豬中均符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)；在品種間，C-101G和C-569G位點的基因型頻率呈極顯著差異(P<0.01)，藏豬群體中的優勢基因型均為CC型，大約克豬群體中的優勢基因型為GG型。

通過網站轉錄因子預測發現SNPs位點堿基突變前后部分轉錄因子結合位點消失和新轉錄因子產生，發現藏豬ACADM基因5′側翼區2個SNPs位點C-101G突變后存在Tcf12、KLF5、KLF1、KLF4等轉錄因子結合位點；C-569G突變后存在CEBPA、CEBPB、Rxra等多個轉錄因子結合位點，這些位點大多參與動物機體生長發育，調控脂肪沉積和低氧誘導因子信號通路，這可能與ACADM基因的表達調控有關。

2.3 不同組織中ACADM mRNA定量分析比較

由圖2可見，藏豬肝臟、背脂、背最長肌和心臟組織中ACADM mRNA水平均極顯著高于大約克豬(P<0.01)。

2.4 藏豬、大約克豬屠宰胴體重與背膘厚檢測比較

由表4可見，180日齡藏豬屠宰胴體重極顯著低于大約克豬(P<0.01)；藏豬的背膘厚極顯著高于大約克豬(P<0.01)。

表3 藏豬、大約克豬ACADM基因多態性位點基因型頻率和等位基因頻率分析

**表示P<0.01

表4 藏豬、大約克豬屠宰胴體重與背膘厚檢測比較

2.5 藏豬、大約克豬肌內脂肪含量測定

由表5可見，180 日齡藏豬背最長肌肌內脂肪含量極顯著高于大約克豬(P<0.01)。

表5 藏豬、大約克豬背最長肌肌內脂肪含量比較 %

2.6 背最長肌ACADM基因表達量與背膘厚、肌內脂肪含量相關性分析

ACADM基因在背最長肌中的mRNA相對表達量與背膘厚呈顯著正相關(P<0.05)，相關系數為0.92；與肌內脂肪含量呈顯著正相關(P<0.05)，相關系數為0.93。

3 討論

ACADM 是中鏈脂肪酸(C4-C12直鏈)β-氧化的關鍵酶，在維持能量平衡中起著重要作用，通過將酰基輔酶A轉化為乙酰輔酶A單元，以作為其他組織的能量來源[13]。現有研究發現，在藏豬與長白豬的背最長肌組織中，棕櫚酸、棕櫚油酸和花生酸具有顯著的差異，同時飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸及多不飽和脂肪酸2個豬種也具有顯著的差異，但是在中鏈脂肪酸上，現階段并沒有藏豬的相關報道[14-15]。有研究報道，ACADM基因在動物各個組織中均有表達，在肝臟、骨骼肌和心臟等組織中高表達[16]，與本研究的結果基本一致。Ji等[17]通過檢測延邊黃牛和延黃牛ACADM基因在不同組織中的表達水平，發現其在牛的多個組織中均有表達，在肝臟中的表達水平顯著高于其他組織，且在牛脂肪組織中表達水平顯著高于背最長肌，與本試驗中藏豬的結果趨于一致，而與大約克豬的表達模式在肝臟組織中略有差異。可能是由于大約克豬在人工高強度選育下，脂肪沉積能力明顯下降[18]。藏豬是我國青藏高原特有的原始地方品種，至今還未開展系統的選育工作[19]。藏豬具有慢生長速度和高脂肪沉積能力的特點，大約克豬具有快生長速度和高瘦肉率的特性[20]，兩者具有明顯的差異。通過對藏豬和大約克豬背膘厚和肌內脂肪含量測定發現，藏豬極顯著高于大約克豬，完全符合其品種特性。Wang等[21]通過脂肪沉積相關蛋白互作網絡圖發現ACADM基因是導致藏豬高脂肪沉積能力的原因之一。本試驗中，藏豬在肝臟、背脂、心臟和背最長肌組織中mRNA的表達水平均極顯著高于大約克豬，說明ACADM基因的mRNA的表達量與脂肪沉積能力呈正相關，進一步證實了ACADM基因可能影響豬的脂肪沉積性狀。

本試驗在ACADM基因起始密碼子上游1 kb區域發現了2個新的SNPs(C-101G和C-569G)位點，且在品種間C-101G和C-569G位點的基因型頻率呈極顯著差異。通過轉錄因子預測后發現在C-101G位點突變前后出現了新的轉錄因子KLF5編碼的蛋白，該蛋白與機體的脂肪沉積有關，是脂肪細胞分化正轉錄調控的關鍵因子[22-23]。這可能是導致藏豬脂肪沉積能力強、肌內脂肪含量高的原因之一。在C-569G位點突變前后出現了新的CEBPA基因結合位點，該基因對動物脂肪細胞分化、發育和脂肪沉積有重要作用，是控制脂肪沉積和肌內脂肪生成的關鍵調節因子[24-25]。因此推測這2個SNPs位點可能是影響豬脂肪沉積能力的重要調控位點，但具體調控機制和功能尚需進一步研究，下一步將開展不同基因型個體和脂肪沉積性狀的關聯性分析。

4 結論

綜上所述，本試驗通過對藏豬和大約克豬ACADM基因起始密碼子上游1 kb區域DNA序列的多態性和不同組織中ACADM基因mRNA表達量的檢測，以及背膘厚和肌內脂肪含量測定分析，發現ACADM基因mRNA的表達量與背膘厚、肌內脂肪含量呈顯著正相關，該基因可能是影響脂肪沉積性狀及肉品質的重要候選基因，推測C-101G和C-569G這2個SNPs位點可能是影響豬脂肪沉積能力的重要調控位點，為進一步開展ACADM基因對豬脂肪沉積的調控機制研究提供了重要支撐。