雞新城疫、傳染性支氣管炎、禽流感(H9亞型)三聯滅活苗(La Sota株+M41株+Re-9株)應用效果研究

洪素梅，袁月，劉月月，田輝，程藝，張盼濤，王林果，薛景景，劉武杰*，田克恭*

(1. 國家獸用藥品工程技術研究中心，河南 洛陽 471000；2. 普萊柯生物工程股份有限公司，河南 洛陽 471000)

雞新城疫是由新城疫病毒(NDV)引起的一種烈性傳染性疾病，雞群感染后會產生拉稀、精神沉郁、神經紊亂等癥狀[1]，死亡率高，危害嚴重，目前在全世界范圍內流行。雞傳染性支氣管炎是由傳染性支氣管炎病毒(IBV)引起的急性呼吸型傳染性疾病，感染雞常常表現為噴嚏、啰音、呼吸困難等，可造成肉雞增重緩慢、料重比下降，蛋雞產蛋下降、畸形蛋、沙殼蛋增多等[2]，給養禽業造成嚴重的經濟損失。H9亞型禽流感是危害我國養禽業的重要疾病。雖然H9亞型禽流感病毒(H9 AIV)致病力不高，但病毒易變異[3-4]，雞群感染后往往影響其生長性能和產蛋性能，且易引發繼發感染[5-6]，造成重大經濟損失。目前疫苗免疫仍然是預防這3種傳染病的重要措施。

前期研究中，將免疫原性好、保護譜廣的H9N2亞型禽流感流行毒株HuN33株的2個表面基因(HA和NA)與A/PR/8(H1N1)的6個內部基因進行重組，構建獲得H9亞型禽流感Re-9疫苗株?；谠摱局瓿晒撝屏穗u新城疫、傳染性支氣管炎、禽流感(H9亞型)三聯滅活苗(La Sota株+M41株+Re-9株)(以下簡稱“三聯苗(Re-9株)”)。本研究對三聯苗(Re-9株)在實際生產中的有效性進行進一步評價。

1 材料與方法

1.1 疫苗

雞新城疫、傳染性支氣管炎、禽流感(H9亞型)三聯滅活疫苗(La Sota株+M41株+Re-9株)為普萊柯生物工程有限公司GMP車間制備。雞新城疫、傳染性支氣管炎、禽流感(H9亞型)三聯滅活疫苗(以下簡稱“對照苗”)為市場上購買的某公司生產的疫苗。

1.2 抗原

雞NDV的血凝抑制(HI)抗原購自中國獸醫藥品監察所；H9 AIV的HI抗原購自哈爾濱維科生物技術有限公司；IBV的HI抗原購自荷蘭GD公司。

1.3 攻毒用毒株

雞NDV北京株毒種購自中國獸醫藥品監察所；H9 AIV A/CK/HuN/33/08株(簡稱HuN33株)由國家獸用藥品工程技術研究中心制備、保存。

1.4 試驗場所及試驗雞

河南省洛陽市周邊某肉雞養殖場7日齡AA肉雞，1日齡時進行新支二聯活疫苗噴霧免疫。河南省洛陽市周邊某蛋雞養殖場260日齡海蘭褐蛋雞，2周齡時免疫新支流法四聯滅活苗，2月齡時免疫新支流三聯滅活苗，開產前(105日齡)免疫新支流減四聯滅活苗。攻毒試驗在普萊柯生物工程股份有限公司禽用負壓動物房進行。

1.5 肉雞應用效果評價

1.5.1 抗體檢測

10 000羽7日齡AA肉雞頸部皮下免疫三聯苗(Re-9株)三聯苗，0.3 mL/羽。同時設置100只不免疫空白對照雞。免疫前從雞群中隨機抽取30羽采血并分離血清，分別檢測NDV、IBV和H9 AIV的HI抗體。免疫雞及對照雞，于免疫后14 d、21 d、出欄當天各隨機抽取30羽，采血并分離血清，分別檢測上述3種HI抗體。

1.5.2 攻毒保護試驗

免疫后14 d在免疫雞中隨機抽取20羽，同時從對照雞中隨機抽取10羽，路途保溫帶回實驗動物房。隨機抽取10只免疫雞及5只對照雞于負壓隔離器中分別通過肌肉注射進行NDV北京株攻毒保護試驗，攻毒劑量為105.0ELD50/羽，攻毒后連續觀察14 d，攻毒后第5天采集感染雞泄殖腔拭子，接種10～11日齡雞胚進行病毒分離；另10只免疫雞及5只對照雞通過靜脈注射進行H9 AIV HuN33株攻毒保護試驗，攻毒劑量為107.0EID50/羽，攻毒后第5天采集所有雞喉頭及泄殖腔拭子，同只雞的兩種棉拭子混合后作為一個樣品，接種10～11日齡雞胚進行病毒分離。

1.6 蛋雞應用效果評價

8 000羽260日齡產蛋期海蘭褐蛋雞經肌肉注射免疫三聯苗(Re-9株)，0.5 mL/羽。同時設置對照苗免疫組，0.5 mL/羽免疫200羽。另設100羽不免疫雞作為空白對照組。免疫當天、免疫后14 d、28 d、2個月、4個月、6個月分別從三聯苗(Re-9株)和對照苗免疫雞及對照雞中隨機抽取20羽，采血并分離血清，分別檢測NDV、IBV和H9 AIV HI抗體，研究三聯苗(Re-9株)免疫效果。

1.7 數據統計與分析

使用SPSS軟件中的獨立樣本t檢驗方法對2組間抗體檢測數據進行統計分析，使用ANOVA方法對3組間抗體檢測數據進行統計分析，使用Fisher’s exact方法對攻毒保護數據進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 肉雞應用效果

2.1.1 抗體檢測

7日齡AA肉雞于免疫當日從雞群中隨機抽取30羽采血并分離血清，免疫后14、21和35 d從免疫組及對照組中各隨機抽取30羽采血并分離血清，分別檢測NDV、IBV和H9 AIV的HI抗體，結果詳見表1。整體來看，對照組抗體值逐漸降低，至出欄當日降到最低，三聯苗(Re-9株)免疫后14 d即可激發抗體。免疫后21 d，NDV、IBV和H9 AIV的HI抗體均達到高峰，分別為8.6log2、6.2log2、8.3log2。出欄當日(免疫后35 d)，NDV、IBV和H9 AIV的HI抗體分別為8.2log2、5.9log2、7.9log2，均維持在較高水平。三聯苗(Re-9株)免疫AA肉雞后14、21和28 d的HI抗體水平，均顯著高于不免疫對照組。

表1 AA肉雞免疫后不同時間血清HI抗體檢測結果 log2

2.1.2 攻毒保護

免疫后14 d，NDV北京毒株及H9 AIV HuN33株分別通過肌肉注射和靜脈注射攻毒，結果見表2。新城疫免疫攻毒組均未發病，排毒比例均為0/10，對照組發病比例為3/5，死亡比例為2/5，未死亡雞只全部排毒。禽流感免疫攻毒組排毒比例均為0/10，對照組排毒比例為4/5。結果表明，7日齡AA肉雞免疫三聯苗(Re-9株)免疫后14 d即可產生理想的攻毒保護結果。

表2 AA肉雞免疫后14 d NDV和AIV攻毒保護結果

2.2 蛋雞應用效果

260日齡海蘭褐蛋雞于免疫當天及免疫后14 d、28 d、2個月、4個月及6個月，血清中NDV、IBV和H9 AIV的HI抗體效價結果詳見表3。不免疫對照組隨著時間的增加，3種抗體效價逐漸下降。三聯苗(Re-9株)和對照苗免疫后NDV、IBV和H9 AIV的HI抗體均在14 d明顯上升，28 d達到高峰，NDV HI抗體分別為12.0log2和11.5log2，IBV HI抗體分別為7.8log2和7.7log2，H9 AIV HI抗體分別為12.2log2和9.7log2，而后逐漸下降。免疫后28 d至6個月，兩個免疫組的3種抗體均顯著高于不免疫對照組，而三聯苗(Re-9株)免疫組的NDV、IBV的HI抗體效價與對照苗免疫組無顯著差異，但H9 AIV HI抗體效價顯著高于對照苗免疫組。免疫后6個月，三聯苗(Re-9株)免疫組的H9 AIV HI抗體效價為8.5log2，高于6.5log2的血清學標準，也顯著高于對照苗免疫組(5.2log2)。

3 討論

目前疫苗免疫是防控雞新城疫、傳染性支氣管炎、禽流感的重要措施之一。研究表明，H9 AIV不斷進化，易變異[7-9]。本產品前期研究中，選擇來自8個省份的15株代表性分離株，通過血清交叉試驗對毒株抗原性分析，從中選取6個毒株進行交叉攻毒保護試驗，發現HuN33株疫苗對同源毒株100%保護，對異源毒株77%～100%保護，抗原保護譜廣[10]。但該毒株雞胚適應性差、增殖滴度低，不適合作為疫苗株直接使用。為攻克這一難題，應用基因重組技術將該野生型毒株與雞胚高度適應株(PR8株)進行重組，構建的基因重組毒株(Re-9)保持了野生型親本株良好的免疫原性[11]，且雞胚增殖能力顯著提高，是理想的H9亞型禽流感疫苗株。同時選擇經典新城疫疫苗株La Sota和傳染性支氣管炎疫苗株M41研制出了新支流三聯滅活苗。

表3 海蘭褐蛋雞免疫后不同時間血清HI抗體檢測結果 log2

據文獻報道，NDV、IBV和H9 AIV的HI抗體高低與攻毒保護成正相關[12-13]。根據雞場的免疫程序，試驗雞前期已經免疫過相應的弱毒活疫苗或滅活苗，故免疫前體內具有一定水平的HI抗體。肉雞僅在1日齡免疫新支二聯活疫苗時，至出欄當天NDV和H9 AIV的HI抗體僅為3.1log2和3.0log2，存在感染風險；蛋雞對照組在開產前做最后一次免疫，在新支流(Re-9株)免疫后6個月NDV和H9 AIV的HI抗體效價僅為3.5log2和2.9log2，亦存在感染風險。而三聯苗(Re-9株)免疫AA肉雞和海蘭褐蛋雞后14 d即可產生抗體，肉雞出欄當天仍維持在較高水平，且能提供完全的攻毒保護，故肉雞在免疫活疫苗后需加強免疫相應的滅活疫苗或做好生物安全防控，蛋雞需在產蛋高峰期后加強免疫，以保持較高的抗體滴度。由于攻毒時體內仍有部分母源抗體，攻毒對照組未全部發病或排毒。國內有較多廠家生產新支流三聯滅活苗，本產品通過與同類產品在蛋雞上的比較發現，三聯苗(Re-9株)NDV、IBV的HI抗體部分與對照苗免疫組相當，但三聯苗(Re-9株)H9 AIV HI抗體從免疫后28 d至6個月均顯著高于對照苗免疫組。上述結果驗證了H9 AIV Re-9株作為基因重組毒株在免疫原性上的優勢。新支流三聯苗(Re-9株)雞群免疫后抗體產生快，免疫持續期長，可減少蛋雞的免疫次數，減少應激，保障養禽業健康。