1株貓杯狀病毒的分離鑒定及其ORF2序列的遺傳演化分析

李鑫，楊德全，葛菲菲，沈海瀟，劉健，鞠厚斌，王建，趙洪進

(上海市動物疫病預防控制中心，上海 201103)

貓杯狀病毒(feline calicivirus，FCV)是貓科動物中廣泛傳播的病原之一，易感貓常因接觸病貓或其分泌物、排泄物及被污染的籠具等而發病，臨床出現口腔潰瘍、鼻-結膜炎、跛行、流產和肺炎等癥狀，嚴重的甚至可導致死亡。此外，有研究表明，FCV在臨床健康貓中帶毒率也較高，臨床健康貓呈持續感染狀態，這就有利于病毒在貓群中的傳播，導致病毒發生變異，產生致死性毒株[1]。由于貓杯狀病毒變異程度高，不同毒株間差異較大，現有的疫苗免疫保護效果并不理想。

FCV核酸類型為單股正鏈RNA，含有3個開放閱讀框(open reading frames，ORFs)，即ORF1、ORF2和ORF3。ORF1編碼病毒的非結構蛋白；ORF2編碼衣殼蛋白，為病毒的主要結構蛋白；ORF3編碼一個較小的結構蛋白。ORF2可分為A～F 6個區域，其中A區經蛋白酶切割形成成熟的衣殼蛋白，E區含有主要B細胞表位[2]。

FCV對貓腎細胞(CRFK，F81)、犬腎細胞(MDCK)等多種細胞敏感[1,3-4]，病毒在細胞上可獲得較高的病毒滴度。本研究從發病寵物貓的鼻拭子中，用F81細胞分離獲得1株FCV，并進行了全基因組擴增和序列測定，對其ORF2基因進行比較與分析，為研究FCV的分子生物學和將來疫苗株的研發提供了參考和依據。

1 材料與方法

1.1 樣品

貓鼻拭子樣品采集自上海某寵物醫院的發病寵物貓。該病貓為雌性貍花貓，2月齡，未進行疫苗免疫，主要癥狀為口炎。

1.2 細胞和主要試劑

F81細胞，購自北納創聯生物科技有限公司；RNA提取試劑盒，購自Magen公司；貓杯狀病毒熒光RT-PCR檢測試劑盒，購自書扁科技(上海)有限公司；AMV 反轉錄酶等試劑，購自寶生物(大連)工程公司；引物由上海派森諾生物科技股份有限公司合成。

1.3 病毒分離

將鼻拭子樣品經0.22 μm濾器過濾除菌后，接種于F81單層細胞，培養箱中孵育1 h，補液后將細胞瓶置于37 ℃、5% CO2培養箱中繼續培養，觀察細胞病變。當細胞病變達到80%以上時，收獲細胞液，并進行熒光RT-PCR鑒定。

1.4 電鏡觀察

將收獲的細胞液凍融3次后，10 000 r/min離心1 h，除去細胞碎片，隨后上清液與終濃度為10%的聚乙二醇8000(PEG8000)混合過夜。在4 ℃下12 000 r/min離心2 h后，用Tris緩沖鹽溶液(TBS)重懸。經2%磷鎢酸負染后，進行透射電鏡觀察[5]。

1.5 病毒RNA提取及RT-PCR擴增

根據RNA提取試劑盒說明書提取病毒RNA，并進行全基因序列的擴增。引物參考GenBank中已知的FCV全基因序列以及參考文獻[4]進行設計(表1)。PCR反應條件如下：95 ℃預變性2 min；94 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸2.5 min，30個循環；72 ℃延伸10 min。PCR產物送上海派森諾生物科技股份有限公司測序。

表1 全基因擴增引物序列

1.6 全基因測序及ORF2基因分析

將測回的序列在NCBI(BLAST，http://www.ncbi.nlm.nih. gov/)上進行檢索確認，用Lasergene 7.1軟件中的Seqman進行拼接，并登錄至GenBank(登錄號：MT239579)。將所測FCV的ORF2基因序列分別與 GenBank中收錄的國內外參考序列進行比對，用 Megalign、MEGA 6.0等軟件繪制遺傳進化樹。

2 結果與分析

2.1 病毒分離

正常的F81細胞呈梭形，細胞間緊密排列，接種鼻拭子樣品后，24 h出現細胞皺縮、變圓、脫落，呈葡萄串樣病變。取上清，經貓杯狀病毒熒光RT-PCR試劑盒鑒定為FCV陽性。將該分離株命名為SH1。繼續在細胞上傳代2次，均在24 h左右出現細胞病變。各代次的病毒滴度分別為10-8.8、10-8.0和10-9.3TCID50/mL。

2.2 電鏡觀察

FCV-SH1株的F81細胞培養物經電鏡觀察，發現病毒粒子呈球形，無囊膜，大小35～40 nm(圖1)，符合FCV的形態特征。

圖1 分離株的電鏡觀察

2.3 病毒全基因組擴增

用表1中3對引物對FCV-SH1進行RT-PCR擴增，經瓊脂糖凝膠電泳后，可以觀察到約2 400、2 900和2 400 bp左右的3個條帶(圖2)，與預期相符。

2.4 ORF2基因同源性分析

FCV-SH1株ORF2序列與GenBank中登錄的29株國內外參考毒株的ORF2序列進行了同源性比較與分析。結果顯示，FCV-SH1株與其他各毒株的核苷酸同源性為74.1%～79.7%，與中國HRB-SS株的同源性最高，與中國SH株同源性最低；氨基酸同源性為84.5%～90.9%，與美國Urbana株同源性最高，與中國FB-NJ-13同源性最低。與疫苗株F9、F4、225和2024的核苷酸同源性為76.8%～77.7%，氨基酸同源性為86.5%～88.3%。

M. DL15000 DNA分子量標準；1. P1/P2引物擴增產物；2. P3/P4引物擴增產物；3. P5/P6引物擴增產物

2.5 ORF2基因的遺傳演化及部分位點分析

本研究將分離株與29株國內外流行株的衣殼蛋白基因(ORF2)進行了序列分析，并繪制了核苷酸和氨基酸遺傳進化樹(圖3)。結果顯示，30株FCV毒株可以分為2個大分支，即基因群Ⅰ和Ⅱ，核苷酸和氨基酸序列遺傳進化樹是一致的，分離株屬于基因群Ⅰ。從核苷酸序列進化樹(圖3A)可以看出，分離株與中國HRB-SS株和新西蘭KCD株同屬一個小分支；在氨基酸序列進化樹(圖3B)中，分離株與美國Urbana株在同一小分支上。分離株所屬大分支上為來自國內和其他國家的不同分離株，說明FCV的分布可能無明顯的地域性差異。

ORF2可分為A～F 6個區域，分析其中B～F區370～580氨基酸發現，基因群Ⅰ和Ⅱ主要存在3個氨基酸殘基的差異，即377、539和557位氨基酸。如表2所示，基因群Ⅰ分別為天冬酰胺(Asn，N)、丙氨酸(Ala，A)、甘氨酸(Gly，G)，而基因群Ⅱ分別為賴氨酸(Lys，K)、纈氨酸(Val，V)、絲氨酸(Ser，S)。

▲本試驗分離株FCV-SH1；●疫苗株

表2 貓杯狀病毒ORF2基因群Ⅰ和Ⅱ的氨基酸序列分析

3 討論

FCV主要引起家貓出現急性或慢性上呼吸道疾病，而且有許多貓是無癥狀的攜帶者[1]，使得病毒在貓群中廣泛傳播。1998年以來，美國及歐洲報道了多例與FCV感染相關的嚴重全身性疾病(virulent systemic disease，VSD)[6-10]。VSD FCV毒株能導致受感染的貓面部和四肢浮腫、高燒、黃疸、胰腺炎和出血等，死亡率高達60%，即使是接種了疫苗的貓也有可能會發生感染[7]，這使本病的防控面臨很大的挑戰。

ORF2基因編碼衣殼蛋白，ORF2序列的比較分析可用于闡明不同FCV毒株之間的進化關系[11-12]。本研究選取了29株來自美國、英國、德國、日本、韓國等國家的毒株，與分離株進行了ORF2基因的同源性、遺傳演化關系及部分位點的分析。本分離株與分離自犬的213/95株的核苷酸與氨基酸同源性分別為78.0%和88.8%；與分離自獵豹的V276株、GD株和SH株的同源性分別為76.6%，75.3%，74.1%和87.7%，85.7%，84.6%，說明不同宿主的FCV分離株差異性不明顯。從遺傳演化關系來看，分離株與美國Urbana株、新西蘭KCD株等其他不同國家的毒株在同一分支，且關系相對較近，說明基因群Ⅰ的FCV分布無明顯的地域性?；蛉孩蛑饕莵碜灾袊腿毡镜亩局?，這可能是中國和日本特有的，由于所選毒株數量有限，還需要進一步驗證。疫苗株都是屬于基因群Ⅱ，可能是目前免疫效果不理想的原因之一。

Sato等[13]報道基因群Ⅰ和Ⅱ在ORF2的B、F區有4個氨基酸位點的差異，即377、539、557和566位氨基酸。基因群Ⅰ分別為Asn或Asp(N或D)，Ala或Pro(A或P)，Gly(G)，Phe或Leu(F或L)，而基因群Ⅱ分別為Lys(K)，Val(V)，Ser(S)，Tyr(Y)。本研究中基因群Ⅰ和Ⅱ僅在377、539、557位點表現出一致性的差異，分別為N、A、G和K、V、S；566位點處的氨基酸殘基在基因群Ⅰ和Ⅱ中都為F或Y，沒有表現出特征性差異，與Sato等[13]的報道不一致，但與Sun等[14]的報道一致。而這3個氨基酸位點的差異是否對毒株的毒力、致病性等有影響還需要后續深入研究。

FCV抗原變異性很強[15]，這意味著沒有疫苗能中和所有的病毒株，導致當前疫苗免疫很難起到有效的保護。因此，加強FCV的監測，分離更多毒株，并了解其分子生物學特性，能夠為今后篩選疫苗候選株和研發具有較好交叉保護性的疫苗提供科學參考。