環介導等溫擴增技術的最新研究進展

謝佳芮，寇美玲，苗海生

(云南省畜牧獸醫科學院/云南省熱帶亞熱帶動物病毒病重點實驗室/農業部熱帶亞熱帶動物病毒學重點開放實驗室，云南 昆明 650224)

分離和鑒定病原體是診斷感染性疾病的傳統策略和金標準方法，也是開展后續研究的基礎，但需要專業資質的實驗室和技術人員，且耗時耗力，在操作人獸共患病原體時還存在較高的生物危害風險。隨著分子生物學的快速發展，以聚合酶鏈式反應(PCR)為代表的核酸擴增技術，如實時(定量)PCR、多重PCR、免疫捕獲PCR和PCR-ELISA，憑借其高準確性，正在成為替代病原分離的重要診斷手段。然而，PCR技術存在一些固有的缺點，即需要精密的核酸擴增儀才能實現在不同時間維持所需的不同溫度，常規PCR還需要電泳分析擴增結果。世界衛生組織認為，理想的診斷檢測技術應是敏感性高、特異性強、使用成本低、操作簡單快捷、可用于任何環境條件下同時容易獲得操作儀器[1]。因此，發展和使用快速、可視化的現場診斷技術，對防控疫病具有重要的現實意義，也是當前的重點研發方向。為克服PCR技術的短板，Notomi等[2]2000年發明環介導等溫核酸擴增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技術，因其易于操作，有望作為替代PCR技術的分子診斷工具[3]引起研究人員的廣泛興趣。經過20年的發展和完善，LAMP技術已有重要進展，有必要做一個回顧評價。

1 LAMP技術原理

LAMP仍是基于核酸擴增的分子診斷技術，但區別于傳統的方法，其核心和特別之處是使用一種鏈置換DNA聚合酶(BstDNA polymerase)和2對引物(也可以是3對引物)進行核酸擴增反應。BstDNA聚合酶是一種基因工程酶，由大腸桿菌(E.coli)菌株產生，因其含有來自嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillusstearothermophilus)DNA聚合酶的基因(該基因缺失了5′→ 3′外切核酸酶結構域)，同時將麥芽糖結合蛋白(maltose-binding protein，MBP) 基因與該基因融合表達。它具有5′→ 3′ DNA聚合酶活性，但不具有5′→ 3′外切核酸酶活性。因此，BstDNA聚合酶具有較強的熱穩定性和鏈置換活性[4]。其次通過設計2對特殊引物，1對內引物(FIP、BIP)和1對外引物(F3、B3)，還可額外添加1對加速環引物(LF、LB，縮短反應時間)對靶序列上的6個獨立區域進行特異性識別。由于DNA復性以及延伸的溫度是恒定的，所以在恒溫條件下，如65 ℃孵育45～60 min，即可完成核酸擴增反應,反應結束后，可直接靠副產物焦磷酸鎂的沉淀濁度進行判斷，也可以添加熒光染料、或其他核酸染劑進行顯色后觀察[5]。

LAMP反應為三步驟：第一階段為起始模板合成，由1對外引物(F3，B3)擴增出反應的起始模板，外部引物限定了擴增的范圍，同時為內部引物的擴增提供模板。第二階段為啞鈴狀結構生成階段，內引物擴增合成的DNA片段含有和該引物5′端DNA 片段的反向互補序列，所以反向互補序列之間雜交形成莖環結構，另外1條內引物與其互補鏈退火雜交后發生鏈置換合成反應，在擴增的DNA片段的另外一端形成1個莖環結構，2個莖環結構共同形成1個啞鈴狀結構。第三階段為循環擴增階段，以形成的啞鈴結構為起始反應物模板，進行循環擴增，雙鏈DNA復性及延伸的中間溫度是60～65 ℃，在65 ℃左右的時候，DNA處于動態平衡狀態，因此，鏈置換DNA合成在不停地自我循環，1 h即可完成擴增反應[6]。

2 LAMP技術特點

2.1 LAMP技術具備高效簡便性

PCR、熒光定量PCR技術，通常需要1.5～2.0 h完成，LAMP反應沒有退火、復性、延伸過程，30～60 min內即可完成109～1010個數量級的核酸擴增反應[6]。此外，LAMP 檢測僅需一個簡單的恒溫儀器，降低成本，簡化了操作步驟。同時，反應的結果判定不需電泳，可直接根據染料的顏色變化判定結果。由于一些待檢樣品，比如體液、全血，血液培養基中含有抗凝劑、N-乙酰半胱氨酸或抗補體化合物等可以抑制Taq聚合酶活性，因此PCR不能直接檢測未提核酸樣品，但LAMP反應酶即使存在反應抑制劑的情況下也能夠保持其活性，可耐受這些成分，從而使得該測定方法可以在現場直接進行而無需從樣品中提取核酸[7]。

2.2 LAMP技術具備敏感性

一些病原體檢測，LAMP 檢測方法達到甚至超過實時熒光定量PCR的檢測水平，比傳統的PCR方法高 2～5 個數量級，有報道指出最低可檢測10個基因拷貝或更低的檢測限[8-9]，證明比常規方法具有更好的敏感性[6]。

2.3 LAMP技術可靠性強

Ji等[10]使用LAMP法檢測鴨乙肝病毒，結果顯示，qPCR對69份臨床組織樣品和88份血清樣品檢測為陽性，并且LAMP檢測法和qPCR 100%一致。Kato等[11]使用LAMP法和PCR法，對大黃蜂中寄生的微孢子蟲同時進行檢測，均可使用10 pg模板DNA來檢測微孢子蟲，2種方法顯示出相同的靈敏度和檢測的一致性。在查閱大量的文獻資料后，2018年以來，LAMP技術在對禽腺病毒(FAV)[12]、鵝星狀病毒(GAstVs)[13]、流感病毒 (IV)[14]等領域的研究結果都充分說明， LAMP技術可靠性強，檢測結果與PCR、qRCR相比無較大差異，比傳統方法特異性強，靈敏度高。

2.4 LAMP技術具備高特異性

類似巢式PCR，LAMP因有4條特異性引物針對靶基因序列的6個區域，嚴格高效的引物匹配，有任何一處不匹配皆不能進行反應，因此極少出現非特異性擴增的情況，同時不受與靶DNA相似度高的非靶DNA及PCR抑制劑的影響。理論上LAMP法擴增的特異性很高，只要通過判定能否擴增靶基因，就能夠對病原體進行定性檢測。且針對同一病原體的不同血清型設計專門的擴增引物，對多血清型的同一病原體進行定性檢測而不出現假陽性[15]。

2.5 LAMP技術的缺點

首先，LAMP反應的引物設計較復雜，要求較高。2條內引物(FIP、BIP)、2條外引物(F3、B3)、2條加速引物(LoopF、LoopB)。針對靶基因上6段不同的區域，位置嚴苛，只能單向與靶基因結合；LoopF、LoopB 必須分別在F1、F2和B1、B2 之間；FIP、BIP的長度一般會大于40 bp，易形成引物二聚體[16]。通常需要對引物的種類、濃度、反應溫度和時間做優化處理。其次，由于LAMP擴增后得到的產物是多條大的DNA鏈，這些大分子的DNA鏈非常穩定，且不易降解，會形成氣溶膠污染。同時由于LAMP技術很靈敏，少量的陽性污染物會造成假陽性結果，這對操作人員提出了較高的要求。LAMP技術擴增產物，不適于除鑒定外的其他分子生物學目的，通用性較PCR低，在分子生物學使用的歷程上較短，現階段應用于快速檢測的方面較為合適，與常規PCR相比，在穩定性方面有一定的差距。

3 LAMP技術染料及輔助劑的研究進展

3.1 LAMP技術染料

SYBR Green I是一種熒光染料，反應結果陽性時體系呈綠色，陰性體系呈橙色，肉眼就可觀察反應結果，也可置于紫外燈下觀察反應結果。但熒光染料的使用具有兩面性，使用不同的核酸染料會對LAMP反應造成一定的影響。若是反應前加入，由于熒光染料對DNA分子的高結合力和親和力(因為熒光染料會與DNA雙鏈結合，一旦結合其熒光信號會增強800～1 000倍)，從而阻礙BstDNA聚合酶鏈置換活性[17]。反應結束后開蓋加入，存在氣溶膠污染，從而造成假陽性。反應前將SYBR Green I滴加于反應管的蓋上，反應結束后，將染料彈入或離心與反應體系混勻，這種操作方式避免了對反應效率的影響以及產生氣溶膠污染[18]。但此種操作方式需要在特定的情況下使用，防止溫度過高，染料凝固，適用于水浴鍋或者是PCR儀不開熱蓋的模式。使用SYBR Green I，并不能做到特異性的顯示擴增產物，引物二聚體或非特異性擴增產物也能結合熒光染料顯色，易造成假陽性，對引物的設計要求較嚴格[19]。

鈣黃綠素是一種金屬離子指示劑，它與Mn2+離子結合時處于熒光淬滅狀態，當隨著大量DNA雙鏈的合成，反應體系當中產生的焦磷酸根離子副產物，使得Mn2+離子與磷酸根結合而解除淬滅狀態發出熒光。但在2010年，Wastling等[4]發現，與沒有添加指示劑的反應相比，加入鈣黃綠素似乎降低了LAMP的敏感性。實際上，鈣綠黃素的使用對反應體系當中的Mg2+的濃度要求很高，有一定的偏差，都會造成反應結果誤差。鈣黃綠素在一定程度上抑制了LAMP反應，另一個原因是鈣黃綠素和雙鏈DNA之間的相互作用導致了反應靈敏度的降低[20]。

羥基萘酚藍(HNB)也是一種金屬離子指示劑，可與反應體系當中的Mg2+結合而成紫羅蘭色，當DNA雙鏈合成后，生成焦磷酸鎂，失去鎂離子的HNB就變成了天藍色，羥基萘酚藍對LAMP反應體系不存在抑制和影響[21]。但是該種染料在紫外燈下顏色區分不明顯，且無成品化試劑，進行反應時需要按照一定濃度現用現配，且HNB不穩定，不容易保存，使用不便[22]。另一個問題是HNB的顏色反應肉眼區別不明顯，不容易察覺顏色變化，雖然目前很多研究者在使用本方法，但并沒有獲得大家的認可[23]。

PicoGreen的熒光增色效果非常明顯，未結合雙鏈DNA(dsDNA)的染料幾乎沒有熒光。與DNA結合后，嵌入的影響和靜電相互作用固定了染料分子，導致其熒光增強了1 000倍[24]。其次，PicoGreen染料可在25～1 000 μg/L的范圍內定量反應體系中的雙鏈DNA，不容易受到RNA和單鏈DNA的影響，傳統的染料只能檢測DNA和RNA的混合濃度。在提取DNA和RNA時，會有一些酚類、蛋白和氯仿等物質的殘留，但是PicoGreen對DNA的檢測不受此類殘留物質的影響，具有較好的精確性和可靠性，操作簡便、干擾因素少[25]。

3.2 LAMP技術輔助劑

甜菜堿：可以使靶基因序列上富含GC的區域水合作用提高，降低堿基堆積力，一定程度上影響了DNA的分子結構，增強 DNA 聚合酶的穩定性，幫助其順利沿模板延伸[26]。Spiess等[26]發現，甜菜堿通過減少RNA的二級結構，降低RNA的Tm值，保持逆轉錄酶的活性。GC含量高的序列通過甜菜堿的影響，可使Tm值降低，使6條引物的Tm值接近，使反應更加容易進行。

L-脯氨酸：可以使DNA雙螺旋結構不穩定，顯著提高 LAMP 的擴增效率。跟甜菜堿一樣，能減少堿基堆積力，刺激反應的整體速率，對目的 DNA 的選擇性顯著增強，降低無關序列的擴增，從而提高結果的特異性[27]。

其他輔助劑的使用：Fukuta等[28]在RT-LAMP試驗中采用了二硫蘇糖醇(DTT)，發現DTT的巰基可以保護酶的二硫鍵，進而增加酶的穩定性。也有研究者用吐溫20或 NP40 來消除核酸提取殘留的 SDS(0.01%及0.10%) 的抑制作用[29]。在環介導等溫擴增反應體系中添加7.5%的二甲基亞砜(DMSO) 可增加環介導等溫擴增的靈敏度與特異性，抑制引物二聚體的形成，將干擾反應降至最低并克服了假陽性擴增，此法在靈敏度與特異性方面已優于現有的商業化試劑盒[30]。Lin等[31]在LAMP反應體系中通過添加氧化石墨烯(GO)來抑制反應體系的非特異性擴增，在檢測環氧合酶-2(COX2)靶標方面顯示出更高的靈敏度和特異性。近年來有報道顯示聚乙二醇可以加速LAMP 反應的進行，在LAMP反應體系中加入6%的PEG8000可以顯著縮短反應時間[32]。同時，在反應體系中引入 dUTP 進行預擴增，并加入有效的尿嘧啶核苷酸酶 (UNG) 降解含有 dUTP 的擴增產物，能有效防止氣溶膠污染[33]。

4 LAMP技術的應用

4.1 LAMP技術在病毒檢測上的應用

Zhao等[34]使用寨卡病毒(ZIKA)的NS5蛋白編碼區和包膜蛋白(EP)編碼區作為ZIKA檢測的目標序列。應用鈣黃綠素/Mn2+顯色法和實時濁度監測兩種不同的技術來顯示檢測結果。該測定的檢出限為：NS5蛋白編碼區的DNA為0.5×10-9pmol/μL，EP編碼區的DNA為1.12×10-11pmol/μL，與實時逆轉錄聚合酶鏈反應(qRT-PCR)相比，其靈敏度提高了100倍。測試的所有12種非ZIKA病原體的LAMP檢測均為陰性，表明了該檢測方法的高特異性。通過RT-LAMP方法靶向西尼羅河病毒(WNV)的Env基因，在常規實驗室水浴/干熱浴中于63 ℃孵育60 min來完成基因擴增[35]。Zheng等[36]使用LAMP法建立了一種快速而特異的檢測豬圓環病毒3型(PCV3)的檢測方法,與豬圓環病毒2型(PCV2)，偽狂犬病病毒(PRV)和豬細小病毒(PPV)相比，LAMP分析顯示出對PCV3的高特異性。Hu等[37]通過對人呼吸道合胞病毒(hRSV)A、B亞型的M和M2-2基因分別設計特異性引物，以SYTO-9為熒光染料進行逆轉錄環介導等溫擴增(RT-LAMP)，結果證實HRSV-A和HRSV-B之間無交叉反應，RT-LAMP和RT-PCR對臨床樣品的陽性檢測率分別為67.8%和55.6%，且RT-LAMP的陽性檢出率明顯高于RT-PCR。現已開發了多種LAMP技術用于其他病毒，包括人類免疫缺陷病毒(HIV)等多種對人類生產與生活具有重要影響的病毒的診斷[38]。

4.2 LAMP技術在細菌檢測上的應用

Lin等[39]應用實時熒光環介導等溫擴增技術，首次鑒定溶血鏈球菌亞種(SGG)。該方法不會與其他溶血鏈球菌亞種和大腸桿菌發生交叉反應。應用LAMP-磁珠法，通過靶向3a序列來檢測耶爾森氏菌[40]。相關結果表明，LAMP的靈敏度高于PCR，而DNA的磁珠捕獲可以顯著提高LAMP的靈敏度。研究者開發了一種穩定的即用型LAMP測定法用于檢測豬場中的產毒霍亂弧菌，該LAMP測定與常規PCR方法相比，靈敏度高出100倍，將LAMP反應體系加入凍干保護劑凍干后，到野外直接加入緩沖劑復性使用，此方法中的LAMP干試劑混合物在室溫下的保質期為90.75 d，極大地簡化了LAMP的操作步驟[41]。

4.3 LAMP技術在寄生蟲領域的應用

Quyen等[42]建立了環介導等溫擴增快速檢測捻轉血矛線蟲E198A單核苷酸多態性(SNP)的方法，證實LAMP成功檢測到E198A突變，可用于現場樣本中捻轉血矛線蟲β-微管蛋白基因E198A單核苷酸多態性的篩查，為快速檢測耐苯并咪唑的捻轉血矛線蟲的感染，從而預防和控制感染提供了有用的技術手段。我國也建立了針對日本血吸蟲尾蚴鈣結合蛋白基因的LAMP檢測[43]和伊氏錐蟲的LAMP檢測[44]。

4.4 LAMP在其他方面的應用

有研究者開發了同時快速檢測腸桿菌科的磺胺耐藥基因sul1，sul2，sul3的多重環介導等溫擴增(m-LAMP)的分析方法[45]。Horibe等[46]開發了一種RT-LAMP，用于檢測角蛋白19(CK19)mRNA在胃癌中的表達，作為腫瘤轉移的標志。為了監測魚翅產品的國際貿易，保護瀕臨滅絕的鯊魚物種，But 等[47]對12種列入瀕危物種國際貿易公約(CITES)的鯊魚物種建立了快速、方便和靈敏的LAMP檢測方法。

5 LAMP技術與其他技術的聯合應用

5.1 LAMP-微流體技術

有研究人員通過將特定的LAMP引物組溶解在殼聚糖中，并將引物固定在毛細管的內表面上，同時組裝數千個引物標記的毛細管陣列，制成含多個微通道的設備，聯合LAMP技術使用一定的傳感設備定量檢測或肉眼觀察檢測結果，完成了LAMP-微流體技術的升級，并命名該技術為mDC-LAMP，在同一時間完成1個至多個樣本的基因檢測[48]。Liu等[49]利用磁珠與高通量微流體芯片技術，開發了集成環介導等溫擴增分析系統，利用該系統檢測結核分枝桿菌，臨床樣本陽性檢出率為96.8%。

5.2 LAMP-LFD技術

Kaewphinit等[50]建立的LAMP-LFD技術,其原理是LAMP反應產生的DNA產物已經提前經過生物素標記，LAMP產物同由異硫氰酸熒光素(FITC)標記的探針特異性雜交形成復合物，在LAMP反應結束后，將試紙條放入擴增產物的溶液中5～10 min，由于紙相載體有層析作用而使得液相產物擴散，試紙條上的檢測線具有生物素抗性，兩相作用而顯色。LAMP-LFD技術最低檢測限可到5 pg的DNA，且改進了常規LAMP技術的缺陷，靈敏度高、無需昂貴的設備，經濟簡約。

5.3 納米金LAMP標記技術

Draz 等[51]應用納米金探針對腸炎沙門菌LAMP擴增產物進行標記，然后用萊卡顯微鏡采集拉曼光譜進行分析。納米金LAMP標記技術的靈敏度為66 CFU/mL，相較于傳統的PCR法提高了100倍。同時，特異性得到極大的提高，能區分非特異性污染。

5.4 微芯片LAMP檢測技術

Damhorst等[52]在微芯片和硅微芯片上協同移動智能設備用HIV微量全血通過RT-LAMP技術就能檢測到HIV核酸。Ganguli等[53]通過LAMP微芯片技術在智能手機上實現了寨卡病毒反應的實時熒光成像，在簡短的時間內實現疾病的快速診斷和檢測。隨著智能手機的大量使用，其強大的數據處理能力協同LAMP技術和微芯片技術在開發移動健康工具和監視診斷程序方面具有廣闊的發展潛力。

5.5 LAMP-CRISPR技術

LAMP技術與基因編輯技術的聯合使用為LAMP技術帶來了歷史性的革新，基因編輯技術與LAMP技術結合，其檢測靈敏度達到了attomolar級(attomolar =10-3fmol)，能做到識別單個堿基差異[54]。同時，LAMP技術與基因編輯技術的聯合使用，使得該反應可在45 min內檢測到轉基因大豆粉中低至0.05%的CaMV35S啟動子成分[54]，且無非特異性擴增，使得LAMP技術的特異性和敏感性得到了極大提升。

5.6 其他LAMP技術的研究

廖翔等[55]建立了使用中性紅pH敏感指示劑檢測犬細小病毒的LAMP技術。Ji等[10]選擇了一種含有酚紅和甲酚紅的顏色指示劑進行鴨乙肝病毒產物結果分析。Jiang等[56]采用結晶紫染料，通過電化學儀器來記錄電阻的實時變化效率，間接反應了LAMP產物的擴增。Lee等[57]基于LAMP方法聯合ELISA和熔解曲線分析法設計了 LAMP-TM-ELISA 法對結核桿菌的多個耐藥基因突變位點進行檢測，確定多重耐藥結核桿菌，從而指導臨床用藥。

6 前景與展望

我國已有十幾種LAMP檢測試劑盒開發成功并申請了專利[58]。試劑盒的國產化和商業化可建立起更低廉的檢測體系，讓LAMP技術得到進一步的推廣和普及，得以在基層實驗室、床邊檢測和流行病學調查等領域開展深度運用。LAMP 技術本身具備協同和兼容其他技術的特性，可以促使該技術自身得到不斷的改進和提高，讓LAMP技術更加靈活，對靶基因序列的檢測精準度更高。預計LAMP技術將推廣普及用于細菌耐藥性相關的單核苷酸多態性的檢測，以制定最有效的抗菌藥物治療方案,同時在生物安全的維護、海關檢疫、打擊非法走私生物制品、野生動植物非法貿易等領域提供新的技術支撐，能適應預報急性、烈性傳染病和大規模檢疫的需要，在更多領域得到應用。未來將會出現檢測材料成本更加低廉化，操作步驟更加簡便，精確度更高的LAMP技術，在生物技術、分子診療等領域發揮重要作用。