羊主要組織相容性復合體基因多態性及其在抗病育種中的應用進展

孫洪新，劉月，王康，敦偉濤*

(1.河北省畜牧獸醫研究所，河北 保定 071000；2.承德市農林科學院，河北 承德 067000)

隨著養羊業集約化、規模化程度的提高，疾病成為制約行業發展的最重要因素。盡管采取疫苗免疫、藥物治療等方式取得了一定的成果，但隨著環保、抗生素殘留、食品安全等問題的突顯，抗病育種受到了眾多畜牧工作者的關注。主要組織相容性復合體(major histocompatibilitycomplex，MHC)是由一群緊密連鎖的基因群組成的定位于動物某對染色體的特定區域，與免疫應答和抗病性密切相關的多基因家族。MHC基因的產物分布于白細胞表面，故又稱白細胞抗原(lymphocyte antigen，LA)。迄今，已發現了多個物種的MHC，并被命名了不同名稱和縮寫。羊的MHC由于具有高度多態性，并與多種病疾抗性密切相關，已成為近年來羊抗病育種研究的熱點。

1 羊MHC的分類

Stear(1981)最早發現綿羊體內存在MHC，并將其命名為綿羊白細胞抗原(ovine lymphocyte antigen,OLA)。綿羊MHC位于20號染色體上，呈高度的多態性和連鎖不平衡性。根據編碼產物的結構和功能，MHC基因分為MHCⅠ類、MHCⅡ類和MHC Ⅲ 類3種類型。MHCⅠ類基因為編碼組織相容性抗原的基因，所編碼的抗原分子廣泛分布于有核細胞表面，由1條α鏈和1條β鏈通過非共價鍵結合，呈異源二聚體形式存在；MHCⅡ類主要編碼調節淋巴細胞增殖及控制免疫強度的基因，編碼的蛋白分子主要分布于抗原遞呈細胞(如巨噬細胞、樹突狀細胞、B淋巴細胞)表面，也由1條α鏈(重鏈)和1條β鏈(輕鏈)通過非共價鍵緊密結合而成；MHC Ⅲ類基因編碼的分子主要參與免疫反應相關的補體控制和受體的產生，不參與抗原遞呈過程。目前研究發現，綿羊MHCⅠ類基因包含3個基因，分別是OLA-A、OLA-B和OLA-C；MHCⅡ類基因分為a區和b區，其中a區含有DR基因和DQ基因。迄今已在OLA基因a區發現了3個DRA和3個DRB、8個DQA1、16個DQA2以及6個DQB等位基因，b區含有DYA、DYB、DOB等基因。

山羊的MHC基因(goat ovine lymphocyte antigen,GoLA)是Dam等于1979年首次發現的，其結構與OLA、BoLA非常相似，并具有一定的序列同源性。GoLA也分為Ⅰ類、Ⅱ類和Ⅲ類基因，其中Ⅱ類控制基因主要參與基體的免疫應答與調控。目前已發現了18個血清學特異的I類抗原，研究的熱點主要集中在Ⅱ類區DQ和DR亞區的基因上。

2 羊MHC基因多態性

羊MHCⅡ類抗原基因很多，但只有DR和DQ區基因在蛋白質水平上表達，所以相關研究主要集中在這兩個亞區方面。

2.1 DQ亞區基因多態性

有關綿羊DQ區多態的研究主要集中在DQA基因上。Scott等[1]研究發現了2個DQA基因，分別命名為DQA1和DQA2；Wright等[2]在DQA1位點上檢測到了7個等位基因和1個假基因；Escayg等[3]在DQA2位點上檢測出了16個等位基因；Zhou等[4]對6個綿羊品種的DQA序列進行檢測，檢測出了6種與之前報道不同的基因型；Hickford等[5]對綿羊的DQA2基因進行分析，共檢測到了23個等位基。在國內，成述儒等[6]應用 PCR-SSCP 技術對藏綿羊的DQA1基因的外顯子2(Exon 2)進行多態性檢測，檢測出了56個單核苷酸多態性(single nucleotidepolymorphisms，SNPs)位點，17個DQA1等位基因；劉彬等[7]對貴州白山羊DQA1基因Exon 1進行分析，發現了7個SNPs位點，并推斷其中的C+48T、A+49G位點與貴州白山羊血液免疫指標具有一定的相關性。

綿羊DQB基因多態性研究方面，Feichtlhauer等[8]和Jugo等[9]研究發現綿羊的DQB基因具有豐富的多態性；Oorschot等[10]在美利奴羊DQB基因Exon 2中發現了10種不同的基因型。在國內，彭林澤[11]采用PCR-RFLP方法對中國美利奴(新疆軍墾型)羊和多浪羊DRB1基因Exon2進行檢測，共檢測到了26種基因型；申紅等[12]對多浪羊的OLA-DQB1 Exon 2進行多態性檢測，共檢出了18種等位基因和42種基因型；Hui等[13]對中國美利奴羊OLA-DQB1基因的Exon 2進行檢測，發現了22個等位基因和42個基因型。

Amills等[14]對山羊DQA1基因Exon 2的多態性進行檢測，發現了23個SNPs位點7個等位基因；Zhou等[15]發現山羊的DQA2基因同樣具有豐富的多態性。國內研究也表明DQA具有豐富的多態性，邢鳳等[16]對山羊 DQA1基因Exon 2多態性進行了檢測，共檢測到了6個等位基因，8種基因型；李俊營等[17]對5個山羊品種的DQA1基因的多態性進行分析，檢測到了2個等位基因，3種基因型；柴文瓊[18]在河西絨山羊DQA1基因 Exon2中共檢測到了42個SNPs位點，9個等位基因；邢鳳等[19]對萊蕪黑山羊、波爾山羊和魯波山羊DQA2基因Exon 2的遺傳多態性進行檢測，HaeⅢ限制性內切酶多態性分析檢測到了由3個(A、B、C)等位基因控制的4種基因型,說明山羊DQA2基因Exon 2的多態性較DQA1豐富。

2.2 DR區多態性

DRB3基因多態性檢測方面，孫東曉等[24]在蒙占綿羊和哈薩克綿羊DRB3基因Exon 2中共檢測到了7個復等位基因、17種基因型，與Amills等[14]的研究結果相一致。劉云芳等[25]在新疆多浪羊的DRB3基因Exon 2中共檢測到了24種等位基因；Li等[26]在12個中國本土山羊DRB3基因Exon 2中發現了6個等位基因；楊易等[27]在四川4個地方山羊品種DRB3基因Exon 2中發現了10種等位基因；羅秀剛等[28]對河西絨山羊DRB3基因Exon 2進行檢測，發現了18個等位、31個基因型，其中16個DRB3的等位基因為首次發現。黃蘭等[29]對3個貴州地方山羊品種DRA 基因Exon 5進行分析，發現了C172T 和T176G 2個共同突變位點，而貴州白山羊中還存在1個G205A突變位點，表明貴州地方山羊DRA基因具有較豐富的遺傳多樣性。

3 MHC多態性與抗病性

MHC是第一個被發現與疾病密切相關的遺傳系統，大量研究表明羊MHC與抗病性存在密切相關。

3.1 MHC多態性與寄生蟲病抗性

Hulme等[30]對335只綿羊MHC多態性與蛇形毛圓線蟲病的易感性相關性進行了分析；Outteridge等[31]、Savers等[32]和Stear等[33]證明多種綿羊品種DRB基因的多態性與線蟲病具有相關性。國內，對多浪羊、中國美利奴羊[34]、哈薩克羊[35]DRB1基因第二外顯子多態性進行分析，表明該基因與包蟲病遺傳抗性和易感性相關；杜迎春等[36]對中國美利奴羊DRB1、DQB1分析發現，抗性單倍型綿羊對細粒棘球絳蟲的抵抗力顯著高于非抗性綿羊。

3.2 MHC多態性與腐蹄病抗性

Litchficld等 (1993)檢測發現MHCⅡ類區域限制性內切酶TaqⅠ和PvuⅡ多態位點與綿羊腐蹄病易感性顯著相關；Escayg等(1997)研究綿羊MHC Class Ⅱ域的變異與綿羊抗腐蹄病之間的關系，發現MHC單倍型與腐蹄病的發生存在關聯(P=0.005)[37]。劉秀等[38]研究發現DQA 2基因Exon 2多態性與藏綿羊的腐蹄病相關，并初步推斷等位基因DQA2*F*L具有較強的抵抗腐蹄病的遺傳潛力。Raadsma等(1991)已將DQA2作為了澳洲美利奴和新西蘭考力代羊抗腐蹄病的分子標記基因[37]。

3.3 MHC多態性與癢病抗病性

Millot等(1985)研究表明，OLA抗原直接參與引發癢病，至少與1個癢病的抵抗或易感位點相關；Millot等(1988)研究證明綿羊癢病與OLA基因有一定相關性；Cullen(1989)提出OLA抗原與綿羊癢病呈相關性；Duguid等(1993)利用感染綿羊癢病抗原的倉鼠腦進行試驗，發現Ⅰ類和Ⅱ類MHC基因以及Ⅱ類相關特定區域表達有所增強。

3.4 MHC多態性與其他病的抗病性

Obexer-Ruff等[39]應用30個微衛星標記瑞士山羊和克利奧爾山羊發現DRBP1位點與牛羊水心胸癥(heartwater disease)有直接關系。Larruskain等[40]研究發現，DRB1基因與綿羊肺腺癌和羊慢性進行性肺炎的易感性相關。Singh等[41]研究發現DRB基因多態性與印度山羊品種的慢性細菌性腸炎抵抗性和易感性存在相關。冷清文等[42]對巴什拜羊OLA-DRB3基因第Exon2外顯子多態性和綿羊肺炎支原體(MO)的相關性發現HaeⅢBC和HaeⅢDD基因型與綿MO感染相關，并分別為MO的抗性和易感性基因型；在11種復等位基因中，PstIA是MO易感等位基因，PstIB和HaeⅢC是MO 抗性等位基因。王文文等[43]對中國美利奴羊 OLA-DQB1 基因的Exon 2多態位點與布病易感性進行關聯分析，發現196G/A和 211C/T在病例組和對照組中分別存在極顯著差異和顯著差異，推測它們可能與布病易感性相關。

4 MHC多態在抗病育種中的應用

大量研究表明，MHC的多態性與疾病的抗性和易感性有著極為密切的相關性，在抗病育種學中具有重要作用，可作為抗病育種的首選遺傳標記。我國擁有豐富的地方綿羊與山羊品種資源，開展羊MHC基因與抗病相關性的研究，對于我國羊的抗病育種具有重大意義。當前，對于羊MHC基因數量及分型的研究，大部分集中在Ⅱ類區段的DR區和DQ區，且多采用PCR-RFLP方法對多態性進行分析，存在無酶切位點，無法檢測到多態位點的局限性；很多多態性需要進行進一步的深入研究，才能被用作選種的遺傳標記。目前，新西蘭已經將綿羊MHC-DQA2 基因作為抗腐蹄病的遺傳標記并進行了商業化的推廣，抗病效果良好；在英國，研究人員也選取了綿羊的MHC*0101等位基因作為胃腸道線蟲抗性選育的標記。隨著分子生物學技術的快速發展和研究的深入，在不久的將來，將會有更多的MHC基因位點被用分子遺傳標記在羊抗病育種實踐中加以應用。