miR-106b-3p 和miR-214 在食管鱗癌組織中的表達及其與臨床病理特征的關系

張文娟，郭永澤，程麗敏，李學孔，劉海濤，董 魁，石俊杰，喬冠恩

（1.邯鄲市第一醫院消化科，河北 邯鄲 056002；2.河北工程大學附屬醫院消化科，河北 邯鄲 056002；3.邯鄲市中心醫院消化科，河北 邯鄲 056000；4.魏縣人民醫院消化科，河北 魏縣 056800；5.邯鄲市第一醫院胸外科，河北 邯鄲 056002）

食管癌（esophageal carcinoma，EC）是常見的消化道惡性腫瘤，其中食管鱗癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）是EC 的主要病理類型，我國約90%左右EC 患者是ESCC。研究顯示，在我國食管癌發病率居第5 位，死亡率居第4 位[1]，且我國ESCC 存在臨床治療效果不佳、預后較差的特點[2]。目前針對食管癌治療手段較多，主要包括手術、化療及放療，但總體治療效果較差，患者5 年的生存率約為15%～25%[3]。積極尋找新的食管癌腫瘤標記物，有助于提高食管癌早期診斷，便于食管癌的及時治療，但到目前為止，ESCC 確切的病因及分子調節機制尚未完全闡明。微小RNA（miRNAs）是一種內源性、結構及進化保守，長度約20 個核苷酸單鏈的非編碼小分子RNA，可以通過抑制RNA 翻譯或降解特異性靶mRNA 從而達到調控細胞分化、增殖、凋亡等生物學行為[4]。miRNAs 既可作為致癌分子也可作為抑癌分子，通過調控其靶基因的表達水平而對癌細胞的增殖、凋亡和轉移等產生影響[5]。miR-106b-3p和miR-214 可在多種癌癥中異常表達，但對其在ESCC 中的具體功能，目前鮮有報道。本研究采用反轉錄定量聚合酶鏈反應（RT-qPCR）技術檢測ESCC組織和癌旁正常組織中miR-106b-3p 和miR-214表達水平，并結合臨床病理資料，分析它們之間的關系，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2016 年10 月～2018 年8 月邯鄲市第一醫院確診的行外科手術切除的60 例ESCC癌組織及對應的癌旁正常組織，其中男36 例，女24例，年齡42～76 歲，平均61.5 歲。ESCC 診斷均經過手術及病理證實，手術前均未接受化療或放療，術后有詳細的回訪記錄，切除標本后迅速放進含有RNA保護液的試管中，并在10 min 內迅速凍存到-80 ℃冰箱中，用于后續總RNA 的提取。

1.2 主要試劑及儀器 Trizol 試劑及逆轉錄試劑盒購于美國Invitrogen 公司，PCR 試劑盒購于徳國Roche公司，引物由南京金斯瑞公司合成。紫外分光光度儀 為美國Beckman Coulter 公司生產，熒光定量PCR 儀7500HT 購自美國ABI 公司，電泳儀購自北京六一儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 標本處理及總RNA 的提取 將保存在-80 ℃冰箱中的組織樣本取出，放入有液氮的研缽中進行研磨，按100 mg 組織樣本加1 ml 的Trizol 的比例添加Trizol 試劑，勻漿處理放置5 min。加入新的EP 管中，12,000 r/min 4 ℃離心10 min，上清移入新的EP管中。向上清液中加氯仿，震蕩后放置3 min，4 ℃、12,000 r/min 離心15 min，收集上層水溶液。向水溶液中加異丙醇并充分混勻，放置30 min，4 ℃、12,000 r/min 離心15 min，收集沉淀。加入75%的乙醇洗滌，4 ℃、5000 r/min 離心5 min，去除上清液，保留沉淀。最后加20～30 μl RNase-Free dd H2O，充分溶解RNA?？俁NA 經NanoDrop ND-2000 分光光度計測定濃度及純度，并電泳檢測RNA 完整性，質量合格后用DEPC 水溶解保存在-80 ℃，用于后續實驗。

1.3.2 反轉錄反應 取2 μl RNA 入EP 管中，用DEPC 水加至11 μl，65 ℃放置5 min 后冰浴5 min 離心，加入5×Reaction buffer 4.0 μl、dNTPs 2.0 μl、Rnase Inhibitor1.0 μl、RT 酶1.0 μl，離心后42 ℃孵育60 min，70 ℃反應10 min 后立即取出冰浴冷卻，合成cDNA，于-20 ℃保存。

1.3.3 實時熒光定量PCR 反應 合成cDNA 后，以Roche 公司的Fast Start Universal SYBR Green Master（Rox）熒光定量PCR 試劑盒來擴增目的基因，所有反應設立3 個復孔，采用20 μl 的反應體系，依次添 加SYBR Green Mix、cDNA、Forward Primer、Reverse Primer、ddH2O，通過1 個循環（95 ℃，3 min）的預變性，后40 個循環的變性（94 ℃，12 s)、退火及延伸（62 ℃，25 s），最后進行熔解曲線分析（62 ℃～95 ℃，0.5 ℃/cycles，5 s/次）。根據各個孔熒光信號達到閾值的循環數作為Ct 值，以U6 為內參，結果以ΔCt表示，ΔCt=Ct miRNA-Ct U6，表示組織中miR-106b-3p、miR-214 相對于內參基因U6 的表達水平，根據結果比較miR-106b-3p、miR-214 在癌組織及癌旁組織的差異，并分析其與性別、年齡、淋巴結有無轉移及TNM 分期等臨床病理特征的關系。

1.4 統計學方法 實驗數據采用SPSS 22.0 統計軟件分析，計量資料以（）表示，兩組間比較采用t檢驗，采用ROC 曲線分析miR-106b-3p 及miR-214對ESCC 診斷價值，P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 食管鱗癌組織和癌旁組織中miR-106b-3p、miR-214 表達情況 食管鱗癌組織中miR-106b-3p及miR-214 表達量分別為（0.78±0.13）及（0.91±0.19），癌旁正常組織中miR-l06b-3p、miR-214 表達量分別為（0.31±0.02）及（0.39±0.05），癌組織與癌旁正常組織組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.2 miR-106b-3p 及miR-214 的表達與ESCC 臨床病理特征的關系 不同淋巴結轉移情況、腫瘤TNM分期的ESCC 患者癌組織中miR-106b-3p、miR-214 的表達比較，差異有統計學意義（P＜0.05），不同年齡、性別的ESCC 患者癌組織中miR-106b-3p、miR-214 的表達比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

2.3 miR-106b-3p 和miR-214 診斷 ESCC 的價值ROC 曲線顯示，miR-106b-3p 診斷食管鱗癌的最佳臨界值為0.49，AUC 為0.87，敏感性為87.50%，特異性為81.30%；miR-214 診斷食管鱗癌的最佳臨界值為0.55，AUC 為0.84，敏感性為85.00%，特異性為87.50%，見圖1。

3 討論

miRNAs 是一類長度大小約為20～22 個核苷酸的非編碼小RNA，能夠通過其堿基序列區域與其相應靶目標mRNA 的3'-非翻譯區（3'-untranslated region，3'-UTR）中的互補堿基序列進行完全或不完全的互補結合，在基因的轉錄后階段調控其相應靶目標mRNA 的表達，參與了人體幾乎所有的生物學調節途徑。已證實miRNAs 在腫瘤的發生、進展及轉移中發揮抑癌基因或促癌基因的作用[6]。在人類miRNAs 中，約50%左右的miRNAs 所在的基因組區域與癌癥之間存在密切的聯系。因此，癌組織中異常表達的miRNAs 對腫瘤的早期診斷、組織類型的分類、轉移及預后等方面有著極其重要的價值[7]。

表1 miR-106b-3p、miR-214 表達與ESCC 臨床病理特征的關系（）

表1 miR-106b-3p、miR-214 表達與ESCC 臨床病理特征的關系（）

圖1 miR-1O6b-3p 和miR-214 診斷ESCC 的ROC 曲線

miR-106b 是miR-106b-25 家族中的一員，位于人類7 號染色體且在編碼基因MCM7 的第13 個內含子區域內，在多種腫瘤中異常高表達，具有調控腫瘤細胞遷移、侵襲、增殖等重要的功能。研究表明，miR-106b 在前列腺癌中高表達并且能夠促進癌細胞增殖[8]。在肝癌組織中，高表達的miR-106b 能夠促進E-Cadherin 等上皮標志物的上調且下調間質細胞標志物的表達，從而促進肝癌細胞增殖及侵襲[9]。在晚期乳腺癌患者中，miR-106b 表達升高，并與腫瘤進展相關，TGF-β 誘導的高水平的miR-106b 決定了TGF-β 在乳腺癌中的促腫瘤作用[10]。在ESCC 組織中miR-106b 的表達情況報道較多，但對于miR-106b在ESCC 中起促癌作用還是抑癌作用，結論不一。Okumura T 等[11]通過芯片技術檢測了多種miRNAs的差異表達，確定了miR-574-3p 和miR-106b 的高表達與腫瘤無復發及良好的總生存率相關，其中miR-106b 被認為具有腫瘤抑制作用。另有研究顯示，在ESCC 組織和細胞系中，miR-106b 表達上調，且在食管癌組織中，miR-106b 的表達與淋巴轉移呈正相關，該研究認為miR-106b 有助于ESCC 的侵襲和轉移，具有促癌作用，下調miR-106b 可能是預防腫瘤侵襲和轉移的一種新策略[12]。肖長艷等[13]的研究結果顯示，相對于癌旁組織，食管鱗狀細胞癌腫瘤組織中miR-106b 的表達水平顯著升高，其表達量與淋巴結轉移、腫瘤分期及吸煙有相關性，并且miR-106b 表達水平較低的患者的生存率顯著高于miR-106b 表達水平較高的患者，miR-106b 的表達量是食管鱗狀細胞癌患者獨立預后因子，可用作ESCC 的診斷及判斷預后的生物標志物。但到目前為止，關于miR-106b-3p 在ESCC 中的表達尚未見報道。本研究發現，miR-106b-3p 在ESCC 癌組織中的表達高于其在癌旁組織中的表達，且隨著患者TNM 分期増加及淋巴結轉移而明顯上調，其診斷ESCC 的敏感性為87.50%，特異性為81.30%，與研究報道的miR-106b情況類似[14]，推斷在整個ESCC 的發生發展過程中，miR-106b-3p 起著顯著的促癌作用。

miR-214 在不同腫瘤中的表達水平不同，可作為癌基因或抑癌基因在腫瘤發生、發展、侵襲等過程中發揮作用[15]，已被證實可作為乳腺癌、膀胱癌等多種癌癥的特異性標志物而在臨床中應用[16]。關于miR-214 在ESCC 中的表達，研究顯示其在ESCC組織及細胞中的表達下降，認為miR-214 在ESCC中為抑癌基因[17]。本研究發現，ESCC 癌組織中miR-214 的表達水平高于癌旁正常組織，且miR-214 表達水平與ESCC 分期及淋巴結轉移情況有關，ROC曲線分析顯示其可作為區分ESCC 與正常者的分子標志物，因此，考慮miR-214 為致癌基因，在臨床上可作為新的輔助診斷ESCC 的腫瘤標志物。

總之，miR-106b-3p 和miR-214 在食管鱗癌組織中表達上調，可作為致癌基因參與食管鱗癌的發生發展，且兩者對診斷該病具有一定的價值。