黃甲軟肝顆粒對人血白蛋白致免疫性肝纖維化模型大鼠的影響

高曉新 朱春玥 張茜茜 王佳帥 曹春然 胡宇馳 李雪梅

(北京市藥品檢驗研究院 國家藥品監(jiān)督管理局創(chuàng)新藥物安全研究與評價重點實驗室中藥成分分析與生物評價北京市重點實驗室，北京 102206)

肝纖維化是一種繼發(fā)于多種急慢性肝損傷后的自我修復(fù)機制[1]，是多種慢性肝病向肝硬化發(fā)展的必然共同病理過程[2]。現(xiàn)今肝纖維化的發(fā)生率逐年增加，嚴(yán)重威脅著人體健康和生命安全[3]。由于傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)診斷肝纖維化屬于“積聚”、 “脅痛”、“臌脹”的病理范疇, 并無“肝纖維化”一詞, 中醫(yī)認(rèn)為肝纖維化的基本病機為正虛血瘀, 基本證型為氣陰虛損、瘀血阻絡(luò)，故對此癥以濕熱、氣血蘊結(jié)進行治療, 療效尤以活血化瘀類中藥材和有效單體成分對肝纖維化的效果最佳[4-5]。基于中醫(yī)中藥的理氣疏肝、活血軟堅的理論，黃甲軟肝顆粒用黃芪、葛根、靈芝、鱉甲、三七等中藥為主要成分進行組方。本研究通過建立免疫性肝纖維化大鼠模型來檢驗黃甲軟肝顆粒對肝纖維化的治療作用。

1 材料和方法

1.1 藥物和試劑

黃甲軟肝顆粒干膏粉，購自A公司，批號：HJ170206，用純水配制濃度分別為1.44 g/mL、0.72 g/mL及0.36 g/mL；復(fù)方鱉甲軟肝片，購自B廠，批號：20170604，做為陽性藥用純化水配制成濃度為0.14 g/mL；人血白蛋白(human serum albumin,HSA)，批號：L3844411 A，CSL Behring GmbH.；弗氏完全佐劑，批號：057K9904，Sigma。

1.2 實驗動物

Wistar大鼠，體質(zhì)量280～310 g，SPF級，雄性，72只，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(京)2016-0011，實驗動物使用許可證號：SCXK(京)2015-0033。本實驗已通過北京市藥品檢驗研究院倫理審查，審查編號：ZT-2017-006。

1.3 儀器

AU400型生化儀購自O(shè)LYMPUS；XH6080 γ計數(shù)器購自西核儀廠；Typ3151準(zhǔn)自動化化學(xué)發(fā)光儀購自Lumino。

1.4 造模

1.4.1HSA致免疫性肝纖維化大鼠模型的致敏階段[6]：雄性Wistar大鼠72只，按體質(zhì)量隨機分出12只為陰性對照組動物，其余60只動物進行造模。實驗第1天,大鼠腹股溝皮下注射HSA與弗氏完全佐劑等體積混合溶液;實驗第14天,大鼠腹股溝皮下注射HSA與不完全弗氏佐劑等體積混合溶液;實驗第24天,大鼠腹股溝皮下注射HSA與1/2體積不完弗氏佐劑混合溶液;實驗第34 天大鼠腹股溝皮下注射不加佐劑的HSA。每只動物的致敏劑量8 mg/mL。

1.4.2HSA致免疫性肝纖維化大鼠模型的激發(fā)階段：末次致敏后10 d，對大鼠(除陰性對照組外)腹腔注射ALB進行激發(fā)，2次/周，共8周。激發(fā)劑量分別為：第1周，每次2.5 mg/mL；第2周，每次5 mg/mL；第3～8周，每次10 mg/mL。

1.5 分組與給藥

末次激發(fā)1周后，測定造模動物血清總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)和天門冬氨酸轉(zhuǎn)移酶(AST)。根據(jù)測得的血清ALT值，將造模動物隨機分為5組，即模型組、陽性藥組(復(fù)方鱉甲軟肝片，1.4 g/kg)、黃甲軟肝高、中、低劑量組(14.4 g生藥/kg、7.2 g生藥/kg、3.6 g生藥/kg，分別相當(dāng)于臨床用藥劑量的2倍、1倍和0.5倍,以下簡稱高劑量組、中劑量組和低劑量組)。每組12只，各組給藥1次/d，給藥體積為1 mL/100 g，連續(xù)給藥4周，模型組和陰性對照組給予同體積的純水。

1.6 相關(guān)測定指標(biāo)[7]

給藥結(jié)束后，各組動物測定血清中TP、ALB、ALT和AST、透明質(zhì)酸(HA)、層粘連蛋白(LN)、Ⅲ型前膠原(PCⅢ)、Ⅳ型膠原(Ⅳ-C)，計算A/G比值。摘取肝臟和脾臟稱質(zhì)量，計算上述指數(shù)(g/100 g)。

選取相同部位肝臟制作蘇木素-伊紅(HE)切片，每片隨機選取三個視野，分別按照如下標(biāo)準(zhǔn)記錄肝纖維化病理分級，并取平均值作為該動物肝臟的病理分級依據(jù)[5]。

肝纖維化分級標(biāo)準(zhǔn)：

0級：肝臟組織結(jié)構(gòu)正常，無纖維組織增生。

1級：膠原纖維從匯管區(qū)或中央靜脈周圍向外延伸，但未包繞整個肝小葉。

2級：膠原纖維延伸、相互連接，包繞整個肝小葉。

3級：膠原纖維包繞并分割肝小葉，以致正常肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，假小葉形成，但以大方形假小葉為主。

4級：肝小葉結(jié)構(gòu)完全破壞，假小葉形成，小圓形假小葉>50%，假小葉間有粗大增生的膠原纖維。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 黃甲軟肝顆粒對大鼠肝、脾質(zhì)量和系數(shù)的影響

實驗結(jié)果表明，模型組動物的肝、脾系數(shù)明顯高于陰性對照組，差異極顯著性(P<0.01)，說明HSA致大鼠肝臟形成免疫性肝纖維化造模成立。與模型組比較，黃甲軟肝三個劑量組肝、脾系數(shù)呈現(xiàn)降低趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)差異(見表1)。

表1 黃甲軟肝顆粒對大鼠肝、脾系數(shù)的影響

2.2 黃甲軟肝顆粒對大鼠肝纖維化標(biāo)志物含量的影響

大鼠血清肝纖維化標(biāo)志物含量如圖1所示，與陰性對照組比較，模型組大鼠血清HA、LN和Ⅳ-C含量均顯著升高(P<0.01～0.05)；與模型組比較，三個劑量組血清HA的含量顯著降低(P<0.01～0.05)，高劑量組血清LN、PCⅢ和Ⅳ-C含量顯著降低(P<0.05)。

圖1 黃甲軟肝顆粒對大鼠血清中HA、LN、PCⅢ及Ⅳ-C的影響

2.3 黃甲軟肝顆粒對大鼠血清生化指標(biāo)的影響

結(jié)果如圖2所示，與陰性對照組比較，模型組ALT和AST顯著升高(P<0.01～0.05)；與模型組比較，高劑量組血清ALT顯著降低(P<0.05)，高劑量組與低劑量組血清AST顯著降低(P<0.01～0.05)。

圖2 黃甲軟肝顆粒對大鼠血清中ALT、AST、TP、ALB及A/G的影響

2.4 黃甲軟肝顆粒對大鼠肝臟組織病理學(xué)的影響

陰性對照組大鼠肝組織結(jié)構(gòu)正常，模型組肝臟纖維組織增生、小葉間隔破壞、假小葉形成以及小膽管增生，病變分級(表2)較陰性對照組顯著增大(P<0.01)；陽性藥組、高劑量組及中劑量組肝臟纖維成分增多且呈現(xiàn)出由匯管區(qū)及中央靜脈向外伸展、有的形成纖維間隔，但病變程度比模型組輕，病變分級與模型組比較減小，且具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01～0.05)。低劑量組與模型組比較，無統(tǒng)計學(xué)差異，但其病理組織觀察顯示纖維化程度有減輕的趨勢。

表2 黃甲軟肝顆粒對大鼠肝臟組織病理學(xué)的影響

3 討論

各種肝損害均可引起肝細胞的壞死、再生，進一步發(fā)展為肝纖維化[8]。常用四氯化碳(CCl4)和HSA造大鼠肝纖維化模型，兩模型在死亡率、血清生化及病理形態(tài)上表現(xiàn)大體一致，但機制各不相同[9]。與臨床肝纖維化機制相似，HSA模型為Ⅲ型變態(tài)反應(yīng)，主要在肝門脈匯管區(qū)形成免疫復(fù)合物沉積，從而引起局部炎癥反應(yīng)，進一步刺激膠原增生而造成肝纖維化[10-11]。此模型主要表現(xiàn)為血清TP、ALT、AST、HA和PCⅢ水平升高，ALB、A/G及Ⅳ型膠原-C水平下降，肝、脾臟指數(shù)上升。

纖維化的病因和表型不同，治療策略也不同[12]；聯(lián)合用藥在臨床研究中顯示出了高效低毒的優(yōu)勢[13]。中醫(yī)理論認(rèn)為肝纖維化是氣陰虛損、瘀血阻絡(luò)所致，從“瘀”與“虛”方面探索發(fā)現(xiàn)中醫(yī)藥在抗肝纖維化方面有著明顯的優(yōu)勢[14]。有研究發(fā)現(xiàn)，黃芪、 黃芪總皂苷及黃芪甲苷具有降低肝纖維化大鼠肝功指標(biāo)和組織病理損傷的作用[15-18]，葛根素也具有一定的抗肝纖維化作用[19-20]。基于研究和中醫(yī)理論組方黃甲軟肝顆粒，主要成分為黃芪、葛根、三七、靈芝、鱉甲等。

實驗結(jié)果顯示，黃甲軟肝三個劑量組均能明顯降低血清HA的含量，高劑量能明顯降低血清LN、ALT、AST含量及PCⅢ的水平;高、低劑量組能顯著降低血清AST含量；高、中劑量組明顯減輕模型大鼠肝臟纖維化病理形態(tài)改變。綜上所述，本實驗證實黃甲軟肝顆粒對大鼠HSA致免疫性肝纖維化有一定的療效，為其臨床使用提供依據(jù)。