實驗牛微生物學和寄生蟲學等級及監測地方標準的研究和制定*

李昌文 朱遠茂 夏長友 陳洪巖

(中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所，獸醫生物技術國家重點實驗室，國家禽類實驗動物資源庫，黑龍江省實驗動物與比較醫學重點實驗室，哈爾濱 150069)

實驗動物作為生命科學的重要組成部分，不僅是國家科技創新的重要基礎條件之一，而且是科學研究不可或缺的手段，更是提升科技創新能力的支撐和保障[1]。標準化是實驗動物的根本屬性，質量標準是實驗動物質量控制體系中的重要組成部分，是實驗動物微生物和寄生蟲控制水平的依據，也是對實驗動物進行分級的根本依據[2]。黑龍江省不僅是養牛大省，也是使用牛進行科研、生產、檢定、教學等各項科研教學活動較多的省份。因此，潛在的多種可能發生的人獸共患病給生物安全帶來了極大的威脅。同時，由于潛在的多種牛微生物和寄生蟲的存在，也會影響實驗數據的準確性、可靠性和重復性。近年來，隨著使用實驗牛數量逐年增加，這些風險正被逐漸的增大。目前，國內還沒有與實驗牛相關的國家或行業標準，因此亟需編制黑龍江省實驗牛微生物學和寄生蟲學質量控制標準。

1 標準編制的背景

隨著生命科學研究的不斷深入，實驗牛的應用領域越來越廣泛,例如：(1)畜牧獸醫研究領域。實驗牛作為獸用生物制品的原材料，同時也是獸用生物制品研發及產品檢驗的必備工具；(2)醫學研究領域，利用轉基因牛乳腺生物反應器生產藥用蛋白，利用轉基因奶牛改變牛奶成分，醫學研究中主要用乳牛來制備小牛血清，供免疫學研究用，還可選用健康的牛肌肉、肝臟和體液制備培養基；(3)比較醫學上應用，成熟期牛的一些遺傳學異常作為人類遺傳學比較研究的模型，包括先天性原卟啉癥、神經節苷脂沉積癥、軟骨發育不全性侏儒癥、先天性毛發稀少癥、遺傳性白內障、先天性甲狀腺腫瘤、先天性心臟病、遺傳代謝功能不全等。犢牛在體形和心臟的大小方面與人近似，常用于心血管外科研究。牛既可用于結核病、副結核病、布氏桿菌病等傳染病研究，還可用作代謝病方面如低血鈣、表皮角化癥和發育不全性貧血的研究；(4)科學研究與教學。

《黑龍江省人民政府關于加快現代畜牧業發展的意見》黑政發[2015]25號文件指出，我省是畜牧大省，地處世界公認的黑土帶、黃金玉米種植帶和黃金奶牛養殖帶，地域廣闊、土壤肥沃、氣候冷涼及環境優良，發展畜牧產業具有得天獨厚的資源條件和區位優勢。大力發展乳品業、奶牛、肉牛、生豬養殖及加工業。

黑龍江不僅是我國養牛業的重要基地，也是開展牛病研究的重要地區，包括眾多開展牛病研究的科研院所、大專院校及醫藥企業，如中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所、哈爾濱維科生物技術開發公司、東北農業大學、黑龍江八一農墾大學等。在牛病教學、牛病研究及與牛相關的疫苗生產、教學及其它科學研究中必然使用大量的實驗牛，研究和生產用血清需求量更大。當前，實驗牛多是從市郊或周邊地區購買，其攜帶人獸共患病的病原微生物和寄生蟲情況不明，會帶來許多潛在危險。

我國目前還沒有牛作為實驗動物的標準，進行科學研究與教學使用的牛，只是以外觀健康為標準進行選擇。這些實驗牛可能攜帶有多種傳染病和寄生蟲的病原體，甚至有的牛處于亞健康狀態，患有人畜共患病，用這種動物進行實驗或科學研究，勢必會影響實驗結果，甚至還能導致生物安全及公共衛生安全問題。因此，開展實驗牛的標準化及標準制定工作，對于提高科學研究與教學使用的實驗牛質量、提高科研結果的準確性、確保人身安全以及應對公共衛生風險也非常重要。

2 實驗牛等級的設定

參照國內、外實驗動物等級分類原則，結合實驗牛的生產水平和實驗要求，本標準按照微生物學和寄生蟲學等級將實驗牛劃分為普通級和SPF級，未設定清潔級，主要是根據國內大多數實驗動物專家的意見，考慮與國際實驗動物標準接軌。目前國際上按照實驗動物微生物學和寄生蟲學控制是實驗動物分級的根本標準分為普通級、SPF級和無菌級，不包括清潔級。清潔級和SPF級實驗牛的環境設施標準一致，生產和使用成本相當，在微生物和寄生蟲檢測項目上難以劃定。綜合上述因素，在本標準中，取消清潔級實驗牛的設定。

3 檢測項目選取

3.1 需檢測項目的選擇

主要綜合考慮以下9方面：①普通級和SPF級牛的定義；②國家現行法律法規的要求；③生物安全；④黑龍江省內牛微生物和寄生蟲病的流行病學情況[3-11]；⑤檢測方法的標準以及檢測實驗室的硬件條件；⑥臨近省份和國家的牛微生物寄生蟲病的流行情況[12-13]；⑦適用性和前瞻性；⑧實驗牛的生產管理方式的改變；⑨輸入性微生物和寄生蟲病的防控和管理[14]。

3.2 普通級和SPF級實驗牛寄生蟲檢測項目的選擇

參考上述9方面內容，對普通級牛的檢測項目設置重點考慮人獸共患病以及2015版《中華人民共和國獸藥典》中的條款要求。普通級牛應排除棘球蚴(Echinococcusspp.)、弓形蟲(Toxoplasmagondii)、體外寄生蟲(Ectoparasitesspp.)、隱孢子蟲(Cryptosporidiumspp.)、賈第蟲(Giardiaspp.)和梨形蟲(Piroplasmaspp.)。在《一、二、三類動物疫病病種名錄》和《中華人民共和國進境動物檢疫疫病名錄》中將棘球蚴病和弓形蟲病為二類動物疫病，是重要人獸共患寄生蟲病。根據現有流行病學調查研究資料得出，黑龍江省牛體表寄生蟲感染率很高，對牛的生長和發育影響極大。隱孢子蟲和賈第蟲病為人獸共患寄生蟲病，為GB 5749—2006《生活飲用水生活標準》中規定的唯一排除兩種寄生蟲病原。現在，牛的飼養方式已經發生較大變化，由原來的游牧式為主轉變為舍飼為主，牛與牛及人與牛的接觸時間加長，且水源地距離較近。綜合考慮，將以上兩種寄生蟲列入到普通級牛的檢測項目。牛梨形蟲在2015版《中華人民共和國獸藥典》中為必檢項目，在《一、二、三類動物疫病病種名錄》中也被列為二類動物疫病。

在確定SPF級牛的檢測項目時，除普通級應排除的病原體外，主要是選擇對動物生長發育影響較大(腹瀉病、血液病及繁殖障礙病)以及對實驗結果存在較大影響的病原體。根據已知的流行病學調查研究資料，黑龍江省牛共有體內、外寄生蟲58種，其中蠕蟲(Helminths)35種，占60.34%；球蟲(Eimeriaspp.)感染率為17.33%，是重點排除的寄生蟲。除以上兩種寄生蟲外，牛錐蟲(Trypanosome)病在《一、二、三類動物疫病病種名錄》中被列為二類動物疫病，牛滴蟲病(Bouine trichomoniasis)《一、二、三類動物疫病病種名錄》中被列為三類動物疫病，新孢子蟲病是由犬新孢子蟲(Neosporacaninum)寄生于多種動物而引起的，分布于世界各地，主要危害是引起孕畜流產或死胎以及新生兒的運動神經障礙。同時，對牛的危害尤為嚴重，是引起牛流產的主要原因。然而，綜合考慮，目前牛的飼養方式發生了較大的變化，因此需排除牛滴蟲和新孢子蟲引起繁殖障礙的寄生蟲病原體。

3.3 普通級和SPF級實驗牛微生物檢測項目的選擇

目前我國牛病發生特點是發病率高、病原體耐藥性增強、人畜共患傳染病的幾率上升、肢蹄病、繁殖障礙性和呼吸系統疫病發生率較高、牛疫病種類增多、混合感染問題嚴重、診治難度增大等。根據上述牛病的發生特點和流行趨勢，確定普通級實驗牛病原微生物檢測項目和檢測方法，主要排除攜帶的人獸共患病病原微生物和烈性傳染病病原微生物，具體檢測項目有口蹄疫病毒(Foot-and-Mouth disease virus,FMDV)、布魯氏菌(Brucellaspp.)、牛分枝桿菌(Mycobacteriumbovis)、炭疽芽胞桿菌(Bacillusanthracis)、鉤端螺旋體(Leptospirosisspp.)、伯氏疏螺旋體(Borreliaburgdorferi)及貝氏柯克斯體(Coxiellaburnetii)[15-21]。

自2008年以來，我國牛群爆發嚴重的呼吸道疾病，表現為牛呼吸道疾病綜合征，抗生素治療效果不明顯、發病率高及死亡率高，給養牛業帶來極大的經濟損失。最近幾年我國肉牛及奶牛的存欄量持續下降，牛呼吸道病的爆發是主要原因之一。病原流行病學調查顯示存在多病原感染，其中主要原發病因為病毒性病原，包括牛副流感病毒3型(Bovine parainfluenza virus 3,BPIV-3)、牛傳染性鼻氣管炎病毒(Infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV)、牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viral diarrhea/Mucosal disease virus,BVDV)、牛呼吸道合胞體病毒(Bovine respiratory syncytial virus,BRSV)等。病毒感染呼吸道上皮細胞造成局部損傷，使呼吸道黏膜的防御能力下降，同時引起機體免疫抑制，繼發細菌/支原體感染，如多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida)等，引起嚴重的肺炎，導致牛呼吸道疾病綜合征。流行病學調查顯示，我國牛副流感病毒3型血清陽性率達77.96%(2 960/3 797)，牛傳染性鼻氣管炎血清陽性率達46.03%(3 933/8 545)[22]。我國對牛副流感病毒3型和牛傳染性鼻氣管炎均未進行免疫接種，高血清陽性率說明我國牛群中感染非常普遍。運輸、氣候變化、混群等應激因素常常導致牛呼吸道病原的感染，而作為實驗牛經歷運輸等應激因素是必然的。另外牛病毒性腹瀉、牛副流感病毒3型、牛白血病病毒(Bovine leuknia virus,BLV)等可引起免疫抑制，感染后不宜作為實驗牛，所以本標準排除牛傳染性鼻氣管炎病毒、牛病毒性腹瀉/黏膜病病毒、牛副流感病毒3型、牛莢膜A、B型多殺性巴氏桿菌、牛呼吸道合胞體病毒及牛白血病病毒。犢牛腹瀉是養牛場飼養管理過程中面臨的最主要的奶牛健康問題之一，危害主要表現為飼料利用率下降、治療成本增加以及不同程度的死亡率，造成嚴重的經濟損失。牛輪狀病毒(Bovine rotavirus，BRV)是引起犢牛腹瀉的最主要病原，發病率可高達50%～100%，7日齡以內犢牛最為易感，典型癥狀為嚴重腹瀉、糞便呈水樣、色呈淡黃色、有時混有黏液和血液、犢牛脫水、眼凹陷、四肢無力、消瘦及臥地，感染后不再適合作為實驗牛，故本標準把牛輪狀病毒列為排除的病原之一[23]。結合黑龍江省牛病流行特點確定實驗牛SPF牛病原微生物檢測項目和檢測方法，除普通級應排除的病原體外，排除不攜帶所規定的潛在感染或條件致病和對科學實驗干擾大的微生物，具體包括牛傳染性鼻氣管炎病毒、牛病毒性腹瀉/黏膜病病毒、牛副流感病毒3型、牛莢膜A、B型多殺性巴氏桿菌、牛呼吸道合胞體病毒、牛輪狀病毒、副結核分枝桿菌(Mycobacteriumparatuberculosis)、胎兒彎曲桿菌(Campylobacterfetus)、牛白血病病毒和衣原體(Chlamydiaspp.)。

4 檢測方法

目前寄生蟲檢測方法較為成熟，實驗室通用方法為蟲卵、蟲體及抗體水平的測定，即通過對實驗牛的分泌物、排泄物、毛發、皮膚等樣品收集處理，直接進行蟲卵或蟲體的形態學檢查，確定是否體外寄生蟲等存在。對采集的血液進行血清學診斷，通過抗體水平判定弓形蟲(Toxoplasmagondii)等是否感染牛體。本標準所涉及病原的檢測，均參照相關的國標或行標，具體檢測方法，參照表1所列。

表1 實驗牛寄生蟲檢測方法

在本次地標制定中，對實驗牛進行微生物檢測。首先選擇有國標或行標的檢測方法，未有以上標準的，使用經過中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所牛羊傳染病研究創新團隊建立驗證的方法。牛副流感病毒3型Real-time PCR診斷方法、牛莢膜A、B型多殺性巴氏桿菌多重PCR診斷方法、牛呼吸道合胞體病毒套式Real-time PCR檢測方法、牛輪狀病毒多重半套式Real-time PCR檢測方法為本單位牛羊傳染病研究創新團隊提供的切實可行的方法，這些方法均適用于我國上述牛流行病原的檢測，具有敏感性高及特異性強的特點，并經當地檢測和診斷應用表明上述診斷方法準確可靠。具體檢測方法參照表2。

表2 實驗牛病原微生物檢測方法

5 預期社會效益

本標準的制定可為我省農業實驗動物新資源提供標準及技術保障和為公共衛生乃至生物安全提供重要的基礎條件支撐，實現實驗動物資源建設領域、關鍵技術問題的突破并提升實驗動物科技工作對科技發展與創新的支撐能力和水平。本標準的實施可為動物養殖業的健康可持續性發展起到推動作用，為重大動物疫病研究提供高質量實驗動物并為生物制品的研發、生產及檢定提供標準化實驗動物。不僅增強生物制品的核心競爭力，推動我國傳統生物制品產業技術升級，提升我國相關產業競爭力和國際影響力，進而帶動我省乃至我國畜牧業行業技術進步及健康發展，確保阻斷人畜共患病對人類健康的影響，促進經濟、社會健康及持續發展具有重要意義。不僅如此，還為我國生命科學領域的研究及產業開發提供重要的支撐條件，對解決動物、動物產品及生物制品的技術瓶頸具有重要意義。

6 討論

現行的《中華人民共和國標準化法》第二條中規定：標準包括國家標準、行業標準、地方標準、團體標準及企業標準。國家標準分為強制性標準及推薦性標準。行業及地方標準是推薦性標準，賦予了地方標準明確的法律地位。第十三條規定：為滿足地方自然條件、風俗習慣等特殊技術要求，可以制定地方標準，地方標準應具有地方的特色。黑龍江省地方標準《實驗動物牛微生物學等級及監測》和《實驗動物牛寄生蟲學等級及監測》的研究和制定就是充分考慮到黑龍江省特殊的地理位置和氣候條件并結合實驗牛的主要傳染性疾病的發生發展規律而制定的，比如流行性出血熱和血吸蟲病是牛的烈性傳染病，但是由于我省特殊的地理生態條件，這兩種病原體均未列為檢測項目。

充分的收集和整理流行病學資料，做好深入的調研和分析是制定實驗牛微生物學和寄生蟲學檢測標準的重要前提。目前，我省正在大力推進“兩牛一豬”項目，近幾年來從國外引進的奶牛和肉牛的數量較大，這給輸入性動物疫病的防控帶來了極大的壓力和隱患。同時，目前我國畜牧業的發展趨勢是產能北移及產品南移，這將會造成人流和動物流的頻繁交叉，給國內動物疫病的流動提供了便利。由于時間和能力所限，針對上述發生的現象，標準編制小組調查分析做的還不夠充分，使得本標準的前瞻性顯得不強。