祖卡木顆粒通過抑制急性肺損傷大鼠MAPK信號通路抗炎作用機制研究?

侯帥紅， 韓林濤， 周禎祥， 黃 芳， 尹 強,△， 韓祥志， 穆丹丹， 董雨薇

(1.新疆維吾爾藥業有限責任公司， 烏魯木齊 830000；2.湖北中醫藥大學， 武漢 430000)

炎癥反應是一種保護宿主免受全身感染、協助機體恢復組織內穩態的自身反應，可由損傷、感染和刺激所引起[1]，因此炎癥反應是一種重要的防御機制，對機體健康具有保護作用[2，3]。如果急性炎癥反應在程度或持續時間上失常，則可導致眾多疾病的發生[1,3]。如上呼吸道感染嚴重時可引起支氣管炎乃至肺炎，失調的急性炎癥反應可導致急性肺損傷，進而導致肺纖維化的發生，影響氣體間的交換。若病情不能得到及時有效的治療，可進一步發展為急性呼吸窘迫綜合征、哮喘及慢性阻塞性肺疾病等肺部疾病。

祖卡木顆粒(zukamu granules，ZKMG)作為維吾爾醫特色制劑，具有調節異常氣質及清熱、發汗、通竅等功效，用于治療感冒咳嗽、發熱無汗、咽喉腫痛、鼻塞流涕等[4]，其適應癥屬于中醫學表證范疇，相當于現代醫學上呼吸道感染及傳染病初期的癥狀，多由鼻腔、咽喉部感染病原微生物引起，屬黏膜急性炎癥。有大量研究表明，ZKMG 具有解熱、鎮痛、抗炎等功效，無明顯毒副作用[5-7]。另外，侯帥紅等圍繞ZKMG 揮發性成分和網絡藥理學在線分析方法預測到其發揮抗炎作用可能與花生四烯酸代謝、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號通路、核因子-κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)信號通路的激活有關[8]，但是還未有相關生物學實驗驗證。大鼠急性肺損傷模型由于其具有操作簡單，模型穩定等優點，目前在評價藥物抗炎活性時被廣泛使用[9]。本試驗通過大鼠急性肺損傷模型，觀察ZKMG 對于大鼠肺組織炎性病理損傷的治療作用，并探討其抗炎的相關作用機制。本研究已通過湖北中醫藥大學實驗動物倫理委員會批準，倫理批準號HUCMS 201903001。

1 材料與方法

1.1 動物

SD 大鼠6周齡雌雄各半，體質量(200±25) g, 購自湖北省疾控中心，實驗動物生產許可證號SCXK(鄂)2015-0018)。適應性飼養3 d，飼養環境為溫度22～26 ℃，相對濕度 50%～60%，人工光照明暗各12 h，給予標準飼料和純凈水喂養。

1.2 藥物

祖卡木顆粒(ZKMG，新疆維吾爾藥業有限責任公司，國藥準字Z65050179)；脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)(Sigma公司，L2630)；地塞米松(dexamethasone，DEX)(Sigma公司，D1756)。

1.3 主要試劑

甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase ，GAPDH)抗體(CST公司，#2118)；p38 MAPK 抗體(Abcam公司，ab170099)；磷酸化p38 MAPK 抗體(Abcam公司，ab47363)；細胞外調節蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK )抗體(Abcam公司，ab17942)；磷酸化ERK 1/2 抗體(Abcam公司，ab201015)；c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)抗體(Abcam公司，ab179461)；磷酸化JNK 抗體(Abcam公司，ab124956)；山羊抗兔IgG 抗體(Bioswamp公司，PAB16011)。大鼠(tumor necrosis factor，TNF)-α 定量酶檢測試劑盒(bioswamp 公司，RA20035)；大鼠白細胞介素(interleukin，IL)-6 試劑盒(bioswamp 公司，RA20607)；大鼠IL-1β 試劑盒(bioswamp 公司，RA20020-S)。

1.4 實驗方法

1.4.1 LPS 誘導大鼠急性肺損傷[10]適應性飼養結束后第2天，將48只SD 大鼠稱重，按隨機數字表法隨機分為對照組、模型組、陽性藥物DEX 組和祖卡木低、中、高劑量組各8只。祖卡木低、中、高劑量組大鼠每日分別給予祖卡木灌胃干預處理(1.35 g/kg，2.7 g/kg，5.4 g/kg，相當于人服用劑量的9 g/60 kg，18 g/60 kg，36 g/60 kg)，連續給藥5 d，每天1次；對照組和模型組每日采用等體積生理鹽水進行灌胃處理，DEX組大鼠僅在第5天進行腹腔給藥DEX 處理，給藥劑量為5 mg/kg。第5天給藥結束1 h后，除空白對照組注射等體積生理鹽水外，其他各組大鼠均尾靜脈注射LPS(5 mg/kg)，誘導大鼠急性肺損傷。6 h后采用10%水合氯醛麻醉大鼠，收集肺組織和肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)，將肺組織部分置于10%多聚甲醛中固定，另一部分凍存于-80 ℃保存備用。

1.4.2 大鼠肺泡灌洗液收集 LPS 誘導6 h后采用10%水合氯醛麻醉大鼠，打開胸腔分離肺組織，于左主支氣管處結扎左肺進行氣管插管，采用800 μL生理鹽水灌洗右肺反復3次，以回收液體積大于80%表示合格。收集的混合液采用4 ℃1500×g離心5 min，收集上清液，-80 ℃保存。

1.4.3 蘇木精-伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining，HE)觀察病理損傷情況 將大鼠肺組織置于10%多聚甲醛中進行固定，然后梯度乙醇脫水、二甲苯透明和浸蠟，對組織樣本進行石蠟包埋、切片，切片厚度為5 μm。按照HE 染色試劑盒說明書進行操作，采用光學顯微鏡觀察肺組織形態結構及病理學改變并拍片。

1.4.4 蛋白質印記法(western blot，WB)檢測蛋白表達 將大鼠肺組織剪碎并用液氮研磨，收集組織至1.5 mL離心管內，加入適量RIPA(強)裂解液，經組織勻漿和超聲處理后置于冰上繼續裂解直至裂解完全，經4 ℃ 12000×g離心20 min取上清。采用BCA 蛋白濃度檢測法進行總蛋白定量。取20 μg總蛋白進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，并轉膜至聚偏氟乙烯，使用5%脫脂牛奶(TBST配制)常溫封閉處理1.5 h，經TBST洗膜后使用相應的一抗稀釋液進行孵育，4 ℃過夜。以兔抗p-JNK(1∶1000)、兔抗JNK(1∶1000)、鼠抗p-ERK1/2(1∶1000)、兔抗ERK1/2(1∶1000)、兔抗p-p38 MAPK(1∶1000)、p38 MAPK(1∶1000)為一抗，羊抗IgG(1∶20000)為二抗分別孵育后，取ECL 發光液A和B等量混勻，加在膜的正面與之充分接觸，并使用全自動化學發光分析儀進行檢測。

1.4.5 ELISA 檢測炎癥因子水平 將收集的大鼠BALF上清液，依據酶聯免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒說明書進行操作，測量單位pg/mL，分別檢測炎癥因子TNF-α、IL-6 和IL-1β 的表達水平。

1.5 統計學方法

2 結果

2.1 ZKMG對急性肺損傷大鼠的肺組織病理形態學影響

圖1示，對照組大鼠的肺泡大小均一，肺泡壁較薄，無炎性細胞浸潤。模型組大鼠的肺泡壁明顯增厚，肺泡大小不均且明顯變小，存在大量的炎性細胞浸潤。陽性藥物DEX 組的肺泡壁仍舊增厚，但較模型組顯著降低且肺泡大小有所恢復。不同劑量的ZKMG 處理組也表現出不同程度的炎癥反應，但與模型組比較，均表現出不同程度的緩解，其中高劑量ZKMG 組大鼠肺組織的炎癥情況改善效果最佳。

圖1 大鼠肺組織的病理形態學檢測比較(200×)

2.2 ZKMG 對炎癥因子表達水平的影響

圖2示，在LPS誘導大鼠急性肺損傷模型中，與正常組比較，模型組大鼠BALF中IL-6、IL-1β和TNF-α 含量急劇增加(P<0.001)；與模型組比較，DEX 組及中、高劑量ZKMG 組大鼠BALF 中炎癥因子水平均出現不同程度的下降(P<0.05)，這些結果表明，中、高劑量ZKMG 能夠減少相關炎癥因子的表達。

注：與對照組比較:***P<0.001; 與模型組比較：#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001圖2 大鼠肺泡灌洗液中炎癥因子水平比較

2.3 ZKMG 對炎癥相關信號通路蛋白的影響

MAPK 家族信號通路是調控炎癥發生發展的重要通路之一[11]。為檢測ZKMG 是否通過MAPK 信號通路來發揮其抗炎作用，該實驗分別對其家族蛋白p38、ERK 和JNK 的磷酸化水平進行了檢測。圖3示，與對照組比較，模型組大鼠肺組織中p-p38、p-ERK、p-JNK 水平顯著升高(P<0.001)；與模型組比較，DEX 及ZKMG 各劑量組p-p38、p-ERK、p-JNK 表達量明顯降低(P<0.001，P<0.05)，提示ZKMG 能夠通過抑制MAPK 家族相關蛋白的磷酸化水平來發揮其抗炎作用。

注：與對照組比較：***P<0.001 ; 與模型組比較：#P<0.05；##P<0.01；###P<0.001圖3 大鼠肺組織MAPK 家族成員蛋白表達水平比較

3 討論

MAPK 信號通路是調控細胞多項生命活動的重要信號通路之一，與多種疾病的發生發展緊密相關[12]。在多種因素的刺激下，MAPK 蛋白家族成員發生磷酸化而被激活，進而影響轉錄因子、酶類和細胞骨架相關蛋白等表達，最終調控細胞增殖、凋亡和炎癥反應等多種生命活動。該通路主要包括p38 MAPK、ERK 和JNK 三條經典的信號傳導通路，均可參與炎癥的調控，可通過促進趨化因子的分泌誘導，造成更多巨噬細胞的活化、募集并產生多種促炎因子分泌，加劇局部的炎癥反應[13，14]。且有研究表明，抑制MAPK 信號通路可改善多種炎性損傷[15，16]，達到緩解炎癥型疾病的作用，因此MAPKs 是一些炎癥性疾病的潛在治療靶點。LPS 能夠誘導巨噬細胞中p38 MAPK 和JNK 發生磷酸化，進而促進炎癥反應的發生[17]。劉振寧等[18]研究也發現，急性肺損傷大鼠肺組織中存在嚴重的炎性反應，且與MAPK 信號通路的活化密切相關。在本實驗中，急性肺損傷大鼠肺組織中存在嚴重的炎性損傷，且p-p38、p-ERK 和p-JNK 表達量也明顯上升，給予ZKMG 干預治療后，大鼠急性肺損傷組織中的炎性病理損傷得到了有效改善。

巨噬細胞是吞噬性白細胞，在先天免疫炎癥反應中起重要作用。活化的巨噬細胞分泌各種細胞因子，如TNF-α、IL-1β、IL-6和其他炎性細胞因子[19]，通過激活適應性免疫反應和惡化炎癥反應顯示多效性。中藥控制炎性細胞因子與抗炎治療效果存在直接聯系，是其抗炎效果發揮的基礎條件。其中，TNF-α 是一種重要的促炎介質，參與多種炎癥的信號通路，而且可以調節其他炎性細胞因子的合成和釋放，促進黏附分子的表達，促進LPS 引發的肺損傷的進展。IL-6主要是刺激免疫細胞的增殖和分化，參與機體的免疫應答，并能有效促進血管內皮細胞對炎癥介質及黏附分子的表達，進而增加炎癥反應，是一種促炎因子。IL-1β 在免疫調節和炎癥反應中起重要作用，它能夠促進T細胞和B細胞的增殖分化，對中性粒細胞、巨噬細胞、淋巴細胞有趨化和增強作用，還能夠誘導IL-2、IL-6和TNF 等細胞因子的產生，因此它們是檢測炎癥反應的常見指標。研究發現[20]，在急性肺損傷模型中，LPS 能夠誘導IL-6、IL-1β和TNF-α 等的合成和分泌。在本試驗中，急性肺損傷大鼠BALF 中炎癥因子的表達量出現一定程度的升高，與既往研究結果一致。給予中藥ZKMG 干預后，模型大鼠BALF 中炎性因子的水平顯著下降，且高劑量的ZKMG效果最為顯著。

DEX 是臨床廣泛使用的長效糖皮質激素，常用于治療炎癥、過敏及自身免疫性疾病等。DEX 可以從基因水平調控炎癥相關基因的表達，抑制促炎癥因子的釋放。雖然DEX 具有強效的抗炎作用，但長期服用容易產生毒副作用[21]。ZKMG 是維吾爾醫藥秘方經改良后研制的復方制劑，由山柰、罌粟殼、洋甘菊、大棗、薄荷、甘草、蜀葵子、睡蓮花、大黃、破布木果10 味天然藥材組成，具有解熱、鎮痛和抗炎的作用，已被廣泛應用于治療急性上呼吸道感染等[22-24]。盡管祖卡木的臨床療效已被證實，但其具體抗炎作用機制目前尚不明確，MAPKs 蛋白是否是祖卡木抗炎的作用靶點，目前還未見報道。既往研究發現，薄荷酚類成分和蒙花苷能夠抑制MAPK 通路蛋白JNK、ERK1/2、p38 MAPK 的磷酸化水平，減少促炎因子TNF-α、IL-6、IL-1β 的表達量[25]。甘草中多種成分如甘草素、甘草酸、異甘草酸鎂、黃烷酮和甘草查而酮均能抑制炎癥因子表達和MAPK 相關蛋白的磷酸化水平發揮抗炎活性[26-30]。Feng 等研究發現，大黃通過抑制MAPKs 的激活及炎癥介質的表達降低胰腺炎的程度[31]。Hu 等研究發現，蘆薈大黃素可顯著抑制IL-6和IL-1β 基因的mRNA 表達水平，ERK、p38、JNK 和Akt 的磷酸化來抑制巨噬細胞中LPS 誘導的炎癥反應[32]。前人研究顯示[33，34]，山柰、大棗等也與MAPK 信號通路關系密切。在本試驗中，為探究MAPK信號是否參與大鼠急性肺損傷中祖卡木介導的抗炎作用，通過蛋白質印跡評估了ERK、p38 MAPK 和JNK 的磷酸化水平。給予祖卡木各劑量組干預后，p38 MAPK、ERK 和JNK 的磷酸化水平顯著降低，提示ZKMG 可能是通過抑制MAPK 信號通路發揮其抗炎效應的。

綜上所述，ZKMG 具有顯著的抗炎作用，其具體作用機制可能與抑制MAPK 信號通路的活化和炎癥因子的釋放有關。