柴芩通淋片對臨床分離大腸埃希菌的耐藥逆轉作用?

周金鶴， 楊偉峰， 王 毅， 童 倩， 何忠梅△

(1.吉林農業大學中藥材學院， 長春 130118；2.中國中醫科學院醫學實驗中心， 北京 100700；3.湖北工業大學， 武漢 430068)

泌尿系統感染(urinary tract infection，UTI )是指病原體侵入泌尿系統生長繁殖引起的炎癥反應所致的急、慢性疾病，包括尿道炎(urethritis )、膀胱炎(cystitis)、腎盂腎炎(pyelonephritis)等。臨床引起泌尿感染致病菌主要為大腸埃希菌(Escherichiacoli，EColi)、肺炎克雷伯菌(KlebsiellaPneumoniae，Kpn)、陰溝腸桿菌(Enterobactercloacae，Ecl)和銅綠假單胞菌(P.Aeruginosa，P.a)等，其中大腸埃希菌最為常見，占臨床檢出率的40%-80%[1，2]。臨床治療泌尿系統感染以氟喹諾酮類、頭孢菌素、碳青霉烯類等抗生素控制感染為主[3，4]，但眾所周知，抗菌藥物的廣泛、持續和不當使用，會改變細菌的生存環境帶來選擇性壓力，在這種抗生素壓力誘導下，病原菌可通過多種機制產生對抗生素的耐藥性。在面對日趨復雜、高發的細菌耐藥性問題時，抗生素作用就愈發有限甚至無效。

中醫藥在感染性疾病防治方面有其獨特的理論體系及豐富的臨床實踐，通過抗菌、增強機體免疫能力等多種途徑發揮作用[5，6]，成為臨床解決耐藥菌感染的有效手段。柴芩通淋片(chaiqintonglin,CQTL)由柴胡、黃芩、萹蓄、瞿麥、車前子、苦參、烏藥、地黃、大黃、川牛膝組成，臨床主要用于泌尿系統感染，效果良好。前期實驗研究表明，CQTL可顯著降低泌尿道感染模型小鼠膀胱和腎臟的大腸桿菌菌落形成數,緩解腎臟炎癥反應[7]，對慢性非細菌性前列腺炎大鼠也具有良好的治療效果[8]。但在整個用藥過程中，中藥CQTL是否與抗生素一樣會對細菌產生誘導耐藥作用，尤其對已耐藥的細菌會產生怎樣的影響尚不得而知。本研究擬通過一系列體外實驗，明確中藥CQTL對細菌耐藥特性的影響。

1 材料

1.1 菌株

大腸埃希菌質控菌株(ATCC29522)，購自美國ATCC標準庫；大腸埃希菌臨床分離菌株(編號E5A2、E5A4、E5A6、E5A7、E5A11、E5A12、E5B2、E5B4、E5E5、E5E7、E4C3、 E4C8、E4C12、E4B4、E4B5、E4B6、E6B2、E6B3、E6B4、E6B5)，由中國中醫科學院廣安門醫院檢驗科提供。

1.2 藥物及試劑

柴芩通淋片(CQTL)(石家莊以嶺藥業股份有限公司，批號A1412001)；TTC(美國Sigma公司，批號17779-10)；胰蛋白胨(OXOID，貨號LP0042)；酵母提取物(OXOID，貨號LP0021)；瓊脂粉(Sigma，S-A1296)；頭孢吡肟(cefepime，FEP 中國食品藥品檢定研究院，貨號130524)；頭孢噻肟(cefotaxime sodium，CTX，中國食品藥品檢定研究院，貨號130483)；頭孢呋辛(cefuroxim，CXM，中國食品藥品檢定研究院，貨號C11065300)；頭孢哌酮(cefoperazone，CFP，中國食品藥品檢定研究院，貨號C0684750)；頭孢他啶(ceftazidime，CAZ，中國食品藥品檢定研究院，貨號C0690500)；頭孢西丁(cefoxitin，FOX，中國食品藥品檢定研究院，貨號C0688000)；氨芐西林(ampicillin，AMP，中國食品藥品檢定研究院，貨號1033000)；環丙沙星(ciprofloxacin，CIP，中國食品藥品檢定研究院，貨號1134313)；左氧氟沙星(levofloxacin，LVX，中國食品藥品檢定研究院，貨號C14629730)；慶大霉素(gentamicin，CN，中國食品藥品檢定研究院，貨號130326)；阿米卡星(amikacin，AK，中國食品藥品檢定研究院，貨號1019508)；替加環素(tigecycline，TGC，中國食品藥品檢定研究院，貨號1667643)；磺胺甲惡唑(sulfamethoxazole，SMZ，中國食品藥品檢定研究院，貨號C16998100)；呋喃妥因(furantoin，F，中國食品藥品檢定研究院，貨號C15570900)；美羅培南(meropenem，MEM，中國食品藥品檢定研究院，貨號1392454)；氨曲南(aztreonam，ATM，中國食品藥品檢定研究院，貨號130507)。

SW-CJ-1FD型超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術有限公司)；THZ-D型恒溫振蕩培養箱(蘇州培英實驗設備有限公司)；KBF-240型恒溫培養箱(BINDER)；V-1100型紫外分光光度計(上海美普達儀器有限公司)，MLS-3750高壓滅菌鍋(日本三洋)。

2 方法

2.1 CQTL母液的配制

LB培養基(1 L)：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl10 g，pH7.4～7.6(LB固體培養基加2%瓊脂)，高壓滅菌，4 ℃冰箱保存備用。

CQTL母液：精密稱取CQTL干燥粉加入適量細菌培養基(LB)，充分溶解使其終濃度為0.48 g生藥量/mL，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，4 ℃冰箱保存備用。

2.2 藥敏檢測

參照CLSI推薦的微量肉湯稀釋法，分別測定CQTL及16種抗生素(FEP、CTX、CXM、CFP、CAZ、FOX、AMP、CIP、LVX、CN、AK、TGC、SMZ、F、MEM、ATM)對20株臨床耐藥大腸埃希菌的最低抑菌濃度(MIC)，實驗重復3次并記錄結果。

2.3 CQTL連續培養對20株臨床分離大腸埃希菌抗生素敏感性的影響

挑取20株耐藥大腸埃希菌單菌落于3～5 mL LB肉湯培養基中，280rpm、37 ℃恒溫震蕩培養16～18 h，測定其吸光度A600 nm為0.2(約1×107CFU)備用。CQTL濃度根據2.2實驗結果選擇1/4 MIC。將稀釋菌液與CQTL稀釋藥液1∶1混勻(V:V=1∶1)，280rpm、37 ℃條件的恒溫震蕩培養箱中培養16～18 h，涂布菌液于LB固體培養基，37 ℃條件的恒溫恒濕培養箱生長(16-18 h)保存菌落，一代記作T1，重復以上操作至5代，分別記為T2-T5，原代菌株則記為T0。對CQTL連續培養獲得的5代大腸埃希菌(T1-T5)分別檢測其對16種抗生素(FEP、CTX、CXM、CFP、CAZ、FOX、AMP、CIP、LVX、CN、AK、TGC、SMZ、F、MEM、ATM)的MIC值，實驗重復3次并記錄結果。每組隨機選擇10個接種于LB瓊脂平板的T0-T5菌株單菌落，Image J 8.0軟件測量直徑進行比較。

2.4 細菌耐藥特性改變后的遺傳穩定性研究

對2.3實驗中經1/4 MIC濃度CQTL連續培養發生抗生素敏感性改變的菌株進行連續空白培養至10代，分別記為C1-C10，對獲得的C1-C10菌株分別進行抗生素MIC值檢測，以確定抗生素敏感性改變能否穩定遺傳。

2.5 統計學方法

3 結果

3.1 藥敏結果

表1示，20株臨床分離大腸埃希菌對16種抗生素(頭孢類、青霉素類、氨基糖苷類、喹諾酮類、磺胺類及人工合成抗生素)MIC值進行檢測。表1示，20株臨床分離大腸埃希菌均為多耐藥大腸埃希菌，對頭孢類、氨基糖苷類、喹諾酮類基本多數表現為耐藥，FOX、F多數表現為藥物敏感性適中，MEM因臨床使用較少，基本表現為藥物敏感。

表1 20株臨床分離大腸埃希菌對16種抗生素最低抑菌濃度檢測結果比較(μg/ml)

表2示，CQTL對20株臨床分離耐藥大腸埃希菌MIC值進行檢測。CQTL在0.24 g/mL濃度時對20株臨床分離耐藥大腸埃希菌中的9株細菌(E5A2、E5A11、E5B5、E4B6、E5A4、E5A7、E5B4、E5E5、E4C8)可產生抑菌作用，其MIC值均為0.24 g/mL，結果提示較高濃度的CQTL對部分臨床分離的耐藥大腸埃希菌有抑菌作用。

表2 柴芩通淋片對20株臨床分離大腸埃希菌的最低抑菌濃度檢測結果(g/mL)

3.2 CQTL提取物對耐藥大腸埃希菌抗生素敏感性的影響

圖1示，細菌經過1/4 MIC濃度CQTL連續作用后，部分菌株形態發生改變。以E4B5菌株為例，原代菌株及CQTL連續作用5次后的菌株形態，E4B5原耐藥菌株菌落明顯較干癟，經過CQTL連續作用后的菌株菌落變得更加圓滑、飽滿。圖2示，Image J 8.0軟件T0-T5菌株單菌落直徑測量結果，E4B5原耐藥菌株菌落明顯較小，經過CQTL連續作用后的菌株菌落直徑顯著增大，與T0組比較差異有統計學意義(P<0.01，P<0.05)。表3示，對1/4 MIC濃度CQTL連續作用后的菌株進行16種抗生素敏感性檢測發現，20株臨床分離耐藥菌株中有3株菌出現對CAZ敏感性降低。在經過1/4 MIC濃度CQTL連續作用后，E4B5、E5E7菌株對CAZ的MIC值分別由最初的256 μg/ml、2048 μg/ml降至32 μg/ml，E5A4在經過1/4 MIC濃度CQTL連續作用后的第1代和第2代菌株MIC值恢復為8 μg/ml，后面連續培養后對CAZ的敏感性又有所變化，20株臨床分離大腸埃希菌對其他抗生素未表現出明顯變化。結果表明，在1/4 MIC濃度CQTL連續作用后對部分臨床分離耐藥大腸埃希菌抗生素敏感性有所降低，提示CQTL具有一定的誘導細菌耐藥逆轉的作用。

注：A.E4B5原菌株；B.1/4MIC濃度柴芩通淋片作用1次；C.1/4MIC濃度柴芩通淋片作用2次；D.1/4MIC濃度柴芩通淋片作用3次；E.1/4MIC濃度柴芩通淋片作用4次；F.1/4MIC濃度柴芩通淋片作用5次圖1 E4B5原菌株及柴芩通淋片連續5次用藥后細菌形態變化比較

注：T0.為原代菌株；T1-T5.為柴芩通淋片連續作用1-5代；n=10,與T0組比較：**P<0.01，*P<0.05圖2 E4B5原菌株及連續5次用藥后單菌落直徑(mm)

表3 1/4MIC濃度柴芩通淋片連續作用后臨床分離大腸埃希菌對頭孢他啶最低抑菌濃度變化比較(μg/ml)

3.3 細菌耐藥性恢復遺傳穩定性研究

表4示，對經1/4 MIC濃度CQTL連續用藥5次后恢復CAZ藥物敏感性的菌株進行連續空白培養傳代至10代后抗生素MIC值測定結果示；與經CQTL逆轉后5代的菌株比較，空白培養10代后的菌株其頭孢他啶MIC值幾乎無變化，提示細菌對CAZ敏感性的恢復可穩定遺傳并具有遺傳穩定性。

表4 柴芩通淋片用藥5次與空白培養10次大腸埃希菌對頭孢他啶最低抑菌濃度比較(μg/ml)

4 討論

CQTL由柴胡、黃芩、萹蓄、瞿麥、車前子、苦參、烏藥、地黃、大黃、川牛膝組成。君藥柴胡、黃芩相須為用，用以溫熱膀胱、疏解肝經氣滯。臣藥萹蓄、瞿麥、車前子配伍利水通淋，清肝熱通膀胱，助君藥清瀉肝經及下焦濕熱。佐藥苦參清熱燥濕；烏藥助柴胡疏肝解郁，調經止痛；生地黃防熱傷血瘀；大黃泄熱降火；牛膝利尿下行、助利水通淋之效；諸藥合用[8]疏郁滯之氣，除下焦、膀胱之濕熱，使清濁分、濕熱去、小便清、疼痛止。本研究首先對獲得的20株臨床分離大腸埃希菌進行抗生素敏感性檢測，結果顯示20株臨床分離的大腸埃希菌對FOX、MEM、LVX、F、TGC相對藥物敏感；對FEP、CTX、CFP、CXM耐藥率達到90%以上，與顧麗娜、余建洪[9，10]等報道基本相符。20株臨床分離大腸埃希菌皆為MDR菌株，提示抗生素的廣泛、持續使用可極大程度上誘導細菌耐藥性的產生。沈才宏、王卉[11，12]等研究報道，CTX對泌尿系感染效果較好，而本實驗中20株臨床分離大腸埃希菌對CTX的耐藥率很高，這可能與臨床CTX為治療感染的推薦藥物有關[3]。實驗中CQTL對20株菌中的9株多重耐藥菌株有抑菌作用，CQTL的MIC值為0.24 g/mL，遠高于臨床常用抗生素，可能受體外實驗藥材提取制備方法限制，全方中部分有效組分丟失導致。

研究表明，柴胡地上部分中所含的揮發油可顯著抑制金葡菌、大腸埃希菌、表皮葡萄球菌等多種細菌[13，14]；柴胡水提物可抑制金葡菌、傷寒桿菌，但對大腸埃希菌無抑制作用[15]。黃芩有較強的抑制E.coli作用[16-18]，王娜[19]觀察到黃芩有效成分黃芩苷對大腸桿菌的MIC為1.56 g/L，且黃芩苷的抑菌能力高于黃芩皂苷。董春雷等[20]發現，500 mg/L黃芩素能抑制46.52%的E.coli浮游菌和45.15%生物膜。鄭澤生[21]等研究表明，萹蓄草提取物較低濃度對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌等均有較好的抑菌活性。此外，CQTL方中的瞿麥、地黃、車前子和苦參等也對多種致病菌具有較好的抑菌作用[22-27]。CQTL對除大腸埃希菌外其他菌群如金葡菌、表皮葡萄球菌等都有抑制作用，有助于機體菌群平衡的恢復，對泌尿系感染的恢復也有促進作用。

CAZ作為第三代頭孢類抗生素對β-內酰胺酶較穩定，用于革蘭氏陰性桿菌所致的敗血癥、下呼吸系感染、腹腔膽系感染、復雜性尿路感染和嚴重皮膚軟組織感染，在2015版專家共識CAZ作為指南中尿路感染的推薦藥物[3]。研究發現，在20株分離的耐藥菌中有14株對頭孢他啶出現耐藥，且藥物的MIC值多在64～1024 μg/mL之間，再次提示用藥頻率增加可導致細菌耐藥率的增高[28]。20株臨床分離大腸埃希菌中3株耐藥菌在經過1/4 MIC濃度CQTL連續誘導后，對CAZ藥物敏感性得以恢復，且可穩定遺傳，提示CQTL可在一定程度恢復已耐藥菌株對抗生素的敏感性。有研究表明，黃芩苷[29]、苦參堿[30]以及柴胡皂苷[31，32]除具有抑制大腸埃希菌活性外，還具有促進大腸埃希菌恢復對藥物敏感性的作用，且不易產生耐藥性；多數清熱解毒類中藥如黃連[33]、黃芩、柴胡、連翹、板藍根、苦參、蒲公英、艾草等都具有消除耐藥質粒作用[34]，中藥在消除耐藥質粒后，細菌恢復藥物敏感特性具有穩定遺傳的特點。因此我們推測，CQTL中所含的抑菌有效成分也是其促進耐藥菌恢復抗生素敏感性的有效成分。而這種不同于傳統抗生素的耐藥消除作用，可能是中藥在感染性疾病治療中的新機制和優于傳統抗生素的獨特優勢所在。應對當前日趨嚴重的抗生素耐藥問題，新藥開發速度遠遠跟不上細菌耐藥速度，中藥的耐藥消除作用、促進耐藥菌抗生素敏感性的恢復，對于臨床細菌感染的治療均具有重要意義。

本研究通過模擬臨床用藥時間觀察亞抑菌濃度下CQTL在連續作用后對細菌耐藥特性的影響，發現中藥亞抑菌濃度(1/4 MIC)CQTL部分耐藥菌抗生素的敏感性有所恢復，尤其對臨床常用抗生素CAZ敏感性恢復顯著且可穩定遺傳，初步闡明中藥CQTL在泌尿系統感染疾病治療中具有獨特作用及優勢。由于CQTL成分復雜，其耐藥消除的機理所在仍有待進一步深入開展。