補腎中藥在細胞分子水平調控骨重建的研究?

姜朝陽， 謝興文， 徐世紅， 李鼎鵬， 柳 博， 鐘建春， 林德民， 羅鵬飛

(1.甘肅中醫藥大學， 蘭州 730000；2.西北民族大學附屬醫院， 蘭州 730000；3.甘肅省第二人民醫院， 蘭州 730000；4.甘肅省中醫院， 蘭州 730000)

骨重建(Bone Remodeling)是骨重建單元進行的一種細胞活動，成骨細胞(osteoblast,OB)和破骨細胞(osteoclast, OC)是骨重建單元最基本的構成元素，生理性骨重建是在OC去除礦化骨、OB形成骨基質，二者協調統一下完成的[1，2]，它貫穿于生命的全過程。當機體內環境穩態失衡時，成骨活動與破骨活動的偶聯平衡被打破，進而引發一系列代謝性骨病。如機體雌激素水平下降所引起的內環境紊亂，致使OC過度分化并由骨髓向礦化骨表面移行、黏附，從而導致骨吸收增加、OB活性降低引起骨形成減少，骨微觀結構發生改變，最終導致骨骼脆弱，增加了骨折風險[3]。然而有研究表明[4]，部分補腎中藥的效應物質通過作用于相關靶蛋白，調控成骨與破骨細胞活性，在改善骨代謝方面效果顯著，具有一定的臨床應用價值。因此，本文就補腎中藥在細胞分子水平調控骨重建的相關研究做一述評，旨在為代謝性骨病的防治提供新策略。

1 骨重建

生理性骨重建的完成需要不同骨細胞之間的直接通訊，包括OB(成骨細胞、骨細胞、骨襯細胞)和OC及其前體細胞所組成的骨多細胞單位(bone multicellular units,BMU)[5]。OB主要來源于骨髓基質中的間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stemocells, BMSCs)，BMSCs在Runt相關轉錄因子2(runt-related transcription factor 2,RUNX2)、骨形態發生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)及骨橋蛋白(osteopontin,OPN)等因子誘導下向OB分化，OB不斷增殖、礦化重建骨形態。這一階段的完成需要磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinosito 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)、Wnt蛋白/β-連環蛋白(Wnt/β-catenin)等眾多信號通路共同完成[6]。而OC是骨髓造血干細胞來源的大型多核巨細胞(含有3-100個細胞核)[7]，主要分布于骨皮質及骨內血管周圍，當破骨前體細胞受到巨噬細胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor,M-CSF)和核因子κB受體活化因子配體(receptoractivator of NF-κB ligand,RANKL)激動后，會定向分化為成熟的OC。在此過程中，OC從骨髓向礦化骨表面移行并黏附，發揮生理性骨吸收作用。

生理性骨重建對維持骨代謝平衡有著至關重要的作用，骨重建周期也是一個高度協調、持續終生的過程，由5個緊密銜接的階段構成，即活化、再吸收、逆轉、形成和終止[8]。同時在該過程中，不同的調節因子參與到骨重建周期的每一個階段(見表1)。首先在骨重建活化階段，破骨單核細胞密切監測捕捉任何重建信號，并在M-CSF、RANKL等啟動因子的介導下，彼此識別融合，形成多核巨細胞并迅速移行至礦化部位，啟動第二階段如再吸收。再吸收階段是維持骨量穩定的關鍵，這一過程的進行程度及時間取決于雌激素(estrogen,ER)、降鈣素(calcitonin,CT)等多種激素負反饋調節，一旦內分泌失調，ER、CT等激素分泌不足，不能充分反饋抑制信號則會導致骨的溶解過度。而再吸收過程主要由兩部分構成，一方面OC將碳酸酐酶II產生的質子泵入吸收間室，以溶解礦物質；另一方面當骨表面出現OC時，一些內分泌調節因子如1,25-二羥維生素D3(1,25(OH)2VitD3)、甲狀旁腺素(parathyroid hormone,PTH)、 胰島素樣生長因子1(insulin-like growth factor 1,IGF-1)等通過誘導成骨前體細胞分化、成熟，并促使OB表達RUNX2細胞信號，進而使得OB數目增加并延長細胞壽命[9]。溶骨與成骨前活動同時進行，以達到逆轉前的動態增長平衡，骨重建也由此進入逆轉階段，OC完全消失，成骨細胞發揮骨形成作用。當礦化骨量達到吸收量時，血小板衍生生長因子(platelet derived growth factor，PDGF)、糖皮質激素、瘦蛋白、焦磷酸鹽、軸突導向蛋白4 D(semaphorin4D,Sma4D)等信號因子負反饋抑制并促進OB凋亡，終止骨重建。此時，一個完整的骨重建過程結束，而在這個過程中任何一個階段中斷或沉默都會造成骨吸收和骨形成之間的不平衡，導致代謝性骨病的發生。

表1 骨重建周期及其調節因子[5]比較

2 補腎中藥單體及其有效成分調控骨重建

中醫基礎理論認為，腎為先天之本，主骨生髓，調控機體生長發育及一切生命活動。現代醫學研究發現，補腎中藥單體及其有效成分在靶向調控BMSCs向骨細胞分化有顯著作用。而中醫學依據藥物的性味歸經將補腎中藥分為補腎陽和補腎陰兩大類，補腎陽藥有淫羊藿、杜仲、骨碎補、仙茅、續斷等，補腎陰藥有枸杞子、女貞子、黃精、鱉甲等。這些中藥單體有效成分基本明確，其對應的化學結構也較為清楚，作用靶點更容易探討，因此筆者依據相關文獻將部分藥物單體及有效成分做整理分析(見表2)。

表2 補腎中藥單體及有效成分對骨重建藥理作用情況

3 補腎中藥復方調控骨重建

補腎中藥復方在臨床中已被廣泛應用，尤其在防治OP方面已取得顯著的臨床療效。同時，補腎中藥復方調控骨重建的機制研究也從動物實驗和細胞實驗展開，現從骨形成與骨吸收兩方面探討補腎中藥復方調控骨重建的作用機制。

3.1 補腎中藥復方對骨形成的機制研究

補腎中藥復方是基于中醫腎主骨生髓思想而創立的古今驗方。現代研究發現，這類方劑可通過調控相關基因表達，從而促進BMSCs成骨分化。有研究采用補腎益氣活血方(地黃、淫羊藿、鹿茸、牡蠣、黃芪、紅花)干預雌性去勢OP大鼠，通過檢測治療后骨密度(bone mineral density,BMD)、ALP、Wnt7b、Axin2、RUNX2蛋白及其mRNA表達水平，發現補腎益氣活血方可顯著增加大鼠股骨BMD，下調血清ALP水平，對雌激素水平下降引起的OP有應用價值，推測其過程可能是通過上調Wnt7b/β-catenin信號通路來促進成骨分化[29]。同時學者通過體外細胞實驗發現[30]，補腎活血方組Axin2、RUNX2 mRNA及蛋白表達均上調，證實補腎益氣活血方通過Wnt7b/β-catenin信號通路，促進成骨分化機制。此外，補腎健脾活血方也可以通過上調RUNX2 mRNA基因及蛋白表達促進骨形成。柴爽等[31]建立OP大鼠模型，以補腎健脾活血方(補骨脂、淫羊藿、肉蓯蓉、熟地黃、白芍、黃芪、菟絲子、丹參、當歸、大棗)作為觀察組，給藥3個月后發現，BMP-2、Smad-1、RUNX2、OPG基因和蛋白表達水平均上調，推測補腎健脾活血方可能是通過BMP-2/Smad信號通路，上調RUNX2基因表達，進一步促進OB分化。文獻報道，續骨補腎方(三七、紅花、當歸、血竭、續斷、骨碎補、龍骨、狗脊、淫羊藿、鱉甲、鹿角膠)也可促進OB增殖，并通過細胞分子實驗證實，其作用機制是通過促進BMP-2以及Ⅰ型膠原mRNA的表達促進OB增殖[32]。此外，右歸丸作為補腎陽的常用方劑，在促進骨生長修復骨重建中療效顯著。章建華等[33]通過細胞實驗闡述了其作用機制。研究采用右歸丸含藥血清干預OB，在培養72 h后分別檢測ALP含量，β-catenin、細胞外調節激酶1(extracellular signal-regulated kinase1,ERK1)、細胞外調節激酶2(extracellular signal-regulated kinase2,ERK2)mRNA及其蛋白表達情況，結果顯示腎陽虛組以上指標含量及表達均上調，認為右歸丸作用機制可能是通過Wnt/β-catenin、ERK1/2信號通路，促進OB增殖進而促進骨形成。

3.2 補腎中藥復方對骨吸收的機制研究

左歸丸(熟地黃、山藥、枸杞子、山茱萸、龜板膠、鹿角膠、菟絲子、牛膝)具有補腎滋陰、益精填髓之功效，可顯著提高BMD水平，改善骨微觀結構，是防治絕經后OP的經典方劑。張瀾川[34]采用RANKL誘導小鼠RAW264.7細胞分化為OC，加入ER抑制劑與左歸丸含藥血清共同干預，發現左歸丸含藥血清通過ER途徑下調促炎因子IL-6，上調抑炎因子IL-10，從而發揮對OC分化的抑制作用。此外，有學者通過動物實驗再次驗證了左歸丸通過調節ER水平影響OC活性這一機制。劉立萍等[35]摘除SD雌性大鼠雙側卵巢造OP模型，給藥90 d后取大鼠血清及股骨分析發現，左歸丸治療組OC數量顯著減少，TNF-α、IL-17、RANKL水平明顯下調，推測左歸丸抗去卵巢模型大鼠骨丟失可能是通過減少血清促炎因子，下調RANKL表達，進而抑制破骨細胞活性。同時研究者發現，通過影響自噬相關基因表達水平也可調控OC分化，進一步影響骨吸收。譚登等[36]培養RAW264.7細胞，并誘導細胞破骨分化，采用補腎通絡方(骨碎補、淫羊藿、續斷、全蝎、蜈蚣、白芍、茯苓、甘草)干預4 d后檢測自噬相關因子表達水平，發現補腎通絡組肌動蛋白環數目及組織蛋白酶K(cathepsin K,CTSK)、抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase,TRAP)表達均減少，同時自噬相關基因5(ATG5)、自噬相關基因7(ATG7)、泛素結合蛋白p62(p62)mRNA表達均下調，推測補腎通絡方可能通過下調自噬相關基因表達，間接抑制OC分化成熟。

4 結語與展望

骨重建是一個多細胞、多因子、多通路共同調控、持續終生的過程，對于保持骨骼完整性和維持礦物質穩態至關重要。中醫學認為，腎為先天之本，藏精主骨生髓。《素問·六節藏象論篇》曰：腎者，主蟄，封藏之本，精之處也，其華在發，其充在骨，強調“腎”“精”“髓”“骨”之間互生互化的密切關系。即腎精充足，則骨髓化生有源，骨得髓養則強壯。若腎精不足，骨髓化生乏源，不能濡養骨骼，則會引起骨骼脆弱、骨質疏松[37，38]。同時，隨著高通量技術在醫學領域的應用，逐漸闡明了骨髓干細胞與中醫學“精”的關系，并發現骨髓干細胞的增殖分化過程與先天之精的轉歸高度吻合[39]。研究發現，補腎中藥單體、有效成分、復方均可調控相關基因、細胞因子的表達，進而影響BMSCs成骨分化，促進生理性骨重建。其中淫羊藿苷、山奈酚等有效成分均可通過提高ALP活性，促進OB分化；淫羊藿、杜仲、骨碎補通過Wnt/β-catenin信號通路，調控下游基因的轉錄與翻譯，進一步促進BMSCs成骨分化，重塑骨結構。此外，部分補腎中藥單體及有效成分還可以通過炎癥信號通路實現對OC的調控，減少骨丟失。而補腎中藥復方則主要通過Wnt、BMPs等分子介導的信號通路發揮作用。不難發現，無論補腎中藥單體或復方調控骨重建均與Wnt介導的信號通路具有不可分割的聯系[40]。利用補腎中藥有效成分通過Wnt信號通路靶向改善骨微環境，將為代謝性骨病的防治研究提供新策略。

雖然相關研究已從臨床、動物和細胞多層次展開，但由于中藥有效成分較多，各個有效成分之間、藥物與藥物之間都存在著相互作用關系，導致其調控骨重建的作用機制尚未完全闡明；加之中藥復方成分更為復雜，其調控骨重建過程涉及多種細胞因子、信號通路，而各個信號通路之間又存在協同或抑制關系，為明確分子機制增加了難度。因此，利用生物信息學、網絡藥理學知識，結合細胞、動物實驗進一步分析，從而揭示補腎中藥調控骨重建的細胞分子機制，仍然是值得研究的方向。