復方芩蘭口服液調控流感病毒感染致重癥肺炎動物模型免疫功能的機制研究

郭 清，王 龍，黃 猛，李 允

高州市人民醫院呼吸與危重癥醫學科，廣東 高州525200

流感病毒感染后會激活免疫反應，適度的炎癥反應被激活可能有利于病毒清除［1］，然而，過度激活的炎癥反應可能對宿主造成有害影響，如造成重癥肺炎（severe pneumonia，SP）［2］。研究顯示，感染流感病毒后，具有促炎作用的T輔助細胞17（T helper cells 17，Th17）會增加，而具有抗炎作用的調節T細胞（regulatory T cells，Treg）則會減少，并且隨著病情的加重，Th17/Treg的水平也會升高［3］。而Th17和Treg的分化受到核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）通路的調控，會激活NF-κB通路，從而使Th17/Treg平衡向Th17偏移，引起促炎因子白細胞介素17（interleukin 17，IL-17）等的分泌，導致肺組織損傷［4-5］。近年來，中藥在治療流感和SP中取得了良好的臨床療效。復方芩蘭口服液具有清熱解毒的作用。最新研究［6］證實，其對感染性肺損傷具有較好的治療作用，但是藥物的調控機制尚不清楚。本研究通過動物實驗，主要基于NF-κB通路探討復方芩蘭口服液對流感病毒感染致SP小鼠炎性因子及免疫功能的影響。

1 材料與方法

1.1 毒株與動物H1N1毒株（PR8）（美國典型培養物保藏中心，批號：HCoV-229E）；BALB/c小鼠，雌性，共60只，8～12周齡，由上海斯萊克實驗動物中心提供，實驗動物合格證號：SCXK（京）2018-002。飼養條件：ABSL-2生物安全實驗室，溫度22～26℃，日溫差≤4℃，濕度40%～70%，喂食小鼠維持飼料，自由飲水、攝食。

1.2 試藥及儀器復方芩蘭口服液（黑龍江珍寶島藥業股份有限公司，國藥準字Z20026049，規格：10 mL/支）；HE試劑盒（碧云天公司）；Trizol試劑（美國Invitrogen公司，批號：257403）；逆轉錄cDNA試劑盒、SYBR Green PCR Master Mix qPCR試劑盒（瑞士Roche公司，批號：04897030001）；RIPA裂解緩沖液（Beyotime，批號：P0013K）；BCA試劑盒（武漢博斯特生物技術有限公司，批號：266117）；anti-NF-κB和anti-RelB（Abcam公 司，批 號：HK5704）；PVDF膜（Bio-Rad公司，批號：AMM05633 G）；ELISA試劑盒（碧云天公司，批號：S0026B）；小鼠Treg/Th17表型抗體試劑（Becton Dickinson公司，批號：AM00401）。顯微鏡（Olympus公司）；流式細胞儀（Becton Dickinson公司）；免疫磁珠（Invitrogen公司）；勻 漿 機（Thermo Fisher Scientific公司）。

1.3 動物處理將60只小鼠分為對照組、模型組和觀察組，每組20只。模型組和觀察組根據參考文獻［7］構建流感病毒感染的SP模型。使用80 μg/kg的氯胺酮和10 μg/kg的甲苯噻嗪麻醉小鼠，通過氣管內遞送50 μL的H1N1，H1N1滴度為100 LD50。對照組小鼠滴入等量的溶劑。在滴入H1N1第二天觀察組使用復方芩蘭口服液灌胃［8］，根據人體口服復方芩蘭口服液的劑量，利用人和小鼠體質量換算方法，計算得到復方芩蘭口服液的干預劑量為22 mL/kg，每日1次，連續7天。其他兩組小鼠使用等量的生理鹽水灌胃。干預后模型組共有2只小鼠死亡，而對照組和觀察組隨機在20只小鼠中選擇18只采集樣本進行后續研究。通過眼眶取血獲得血液樣本，小鼠經過頸脫臼處死。本次研究的動物實驗經過倫理委員會批準。

1.4 觀察指標

1.4.1 肺指數及HE染色檢測肺組織損傷小鼠處死前稱質量，處死后取出肺組織，擦干表面組織液后稱質量。首先計算肺指數（全肺質量與體質量之比×100%）。在室溫下用4%多聚甲醛中固定過夜，然后室溫下通過梯度濃度的乙醇（80%持續2 h，90%持續2 h，95%過夜，100%分別持續0.5、0.5、1.0 h處理后包埋在石蠟中。然后將石蠟包埋的樣品切成4 μm的切片，用Mayer′s蘇木室溫下精染色10 min，洗去染色液后加入0.5%曙紅水溶液室溫下染色3 min。細胞核和其他酸性結構被染成藍色，而細胞質被染成紅色。使用光學顯微鏡觀察。

1.4.2 ELISA檢測炎性因子水平將血液樣本以離心半徑：15 cm，2000 r/min離心20 min收集上層清液，根據試劑盒說明書分別加入抗體和顯色劑，然后通過酶標儀檢測450 nm處吸光度，然后根據標準曲線計算白細胞介素1β（interlenkin-1β，IL-1β）、白細胞介素6（interlenkin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的濃度。

1.4.3 流式細胞術檢測Th17/Treg將脾臟中細胞經過密度梯度離心分離淋巴細胞，將淋巴細胞懸浮液重懸，加入20 μL預冷的1×BD Mouse Foxp3緩沖液在黑暗、4℃的條件下固定30 min。洗去固定液離心并收集細胞。在細胞中加入200 μL通透緩沖液，并將細胞在37℃下避光孵育30 min。洗滌后加入20 μL的小鼠Treg/Th17表型抗體試劑或對照抗體在室溫下孵育30 min。然后將抗體清洗干凈后，將細胞重懸并通過FACS Calibur流式細胞儀進行分析Th17和Treg的百分比。

1.4.4 qPCR檢測mRNA小鼠處死后收集脾組織，通過qPCR檢測Th17轉錄因子RORγt mRNA和Treg轉錄因子FOXP3 mRNA的水平，以及NF-κB通路中關鍵基因NF-κB、RelB mRNA的水平。通過TRIzol獲得總mRNA，分別通過PrimeScript-RT和SYBR Premix Ex Taq試劑盒進行反轉錄（37℃/15 min，85℃/5s）和qPCR（95℃/5 min，95℃/30 s/40個循環，65℃/45 s）。GAPDH作為內源參照。通過qPCR分析mRNA的相對表達水平。

1.4.5 Western blot檢測蛋白根據文獻［9］將脾組織裂解為單個細胞，中細胞通過密度梯度離心法分離單個核細胞，使用免疫磁珠分離淋巴細胞。將淋巴細胞勻漿后萃取總蛋白，蛋白濃度通過BCA試劑盒測量。分別取總量為30 μg的總蛋白使用10%的聚丙烯酰胺凝膠進行電泳（80～120 V，90 min）。在100 mV的恒定電壓下與PVDF膜進行濕轉移。在5%牛血清白蛋白中于室溫孵育1 h。加入anti-NF-κB和anti-RelB添加到分離的蛋白質中，并在4℃下孵育過夜，洗滌后在室溫下添加二抗孵育1 h，然后加入化學發光試劑進行顯影，GAPDH作內部參考，用Image J軟件分析目標條帶的灰度值。

1.5 統計學方法所有數據使用SPSS 19.0軟件，計量數據以表示，多組間比較進行單因素方差分析，兩兩比較使用SNK-q檢驗，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 小鼠肺指數肺指數模型組為（16.95±1.47）mg/g，觀察組為（11.20±1.45）mg/g，均高于對照組（7.02±0.94）mg/g；模型組、觀察組均高于對照組（P＜0.05），模型組高于觀察組（P＜0.05）。

2.2 小鼠肺組織損傷程度對照組肺組織一切正常。模型組肺組織出現廣泛的肺部損傷，包括毛細支氣管上皮細胞脫落，并有明顯的出血和炎性浸潤，肺泡結構基本喪失。與模型組比較，觀察組炎性反應等情況明顯緩解，可觀察到基本的肺泡結構。見圖1。

圖1 各組小鼠肺損傷組織程度病理表現（HE×200）

2.3 小鼠Th17/Treg水平模型組Th17和Th17/Treg顯著高于對照組（P＜0.05），而Treg顯著低于對照組（P＜0.05）；觀察組Th17和Th17/Treg顯著低于模型組（P＜0.05），而Treg顯著高于模型組（P＜0.05）。見表1。

表1 各組小鼠Th17/Treg水平比較（）

表1 各組小鼠Th17/Treg水平比較（）

注：*表示與對照組比較，P＜0.05；#表示模型組比較，P＜0.05

Th17/Treg 0.67±0.75*#0.29±0.35 1.63±0.21*組別觀察組對照組模型組鼠數18 18 18 Th17（%）5.23±0.75*#2.80±0.38 7.14±0.94*Treg（%）7.79±1.01*#9.52±0.92 4.38±0.64*

2.4 小鼠IL-1β、IL-6、TNF-α水平IL-1β、IL-6、TNF-α水平模型組、觀察組顯著高于對照組（P＜0.05），觀察組顯著低于模型組（P＜0.05）。見表2。

表2 各組小鼠炎性因子水平比較（） pg/mL

表2 各組小鼠炎性因子水平比較（） pg/mL

注：*表示與對照組比較，P＜0.05；#表示模型組比較，P＜0.05

TNF-α 83.31±10.42*#61.58±4.23 124.66±11.39*組別觀察組對照組模型組鼠數18 18 18 IL-1β 55.03±6.72*#43.62±4.29 75.48±8.35*IL-6 60.24±8.45*#40.82±4.56 84.56±9.57*

2.5 小鼠RORγt、FOXP3 mRNA，NF-κB、RelB mRNA及蛋白表達與對照組比較，模型組、觀察組RORγt mRNA，NF-κB、RelB mRNA及蛋白水平均高于對照組（P＜0.05），FOXP3 mRNA水平低于對照組（P＜0.05）；觀察組RORγt、NF-κB、RelB mRNA及蛋白水平顯著低于模型組（P＜0.05），FOXP3 mRNA水平高于模型組（P＜0.05）。見表3。

表3 各組小鼠脾組織中RORγt、FOXP3 mRNA及NF-κB、RelB mRNA和蛋白水平比較（）

表3 各組小鼠脾組織中RORγt、FOXP3 mRNA及NF-κB、RelB mRNA和蛋白水平比較（）

注：*表示與對照組比較，P＜0.05；#表示模型組比較，P＜0.05

組別觀察組對照組模型組RelB 1.52±0.15*#0.82±0.08 3.04±0.27*鼠數18 18 18 RORγt mRNA 4.02±0.41*#2.34±0.21 6.85±0.65*FOXP3 mRNA 3.35±0.35#3.46±0.31 1.23±0.13*NF-κB mRNA 2.79±0.30*#1.38±0.14 5.24±0.51*RelB mRNA 3.02±0.31*#1.22±0.12 5.16±0.49*NF-κB 1.20±0.13*#0.76±0.08 2.98±0.27*

3 討論

由H1N1等病毒感染引發的流感是世界范圍內的衛生問題，會引起大流行性急性呼吸道疾病。一些嚴重的患者可能會發展為急性肺損傷，甚至出現急性呼吸窘迫綜合征，這是感染了H1N1的患者最常見的死亡原因［10］。研究表明，許多傳統中藥具有免疫調節、抗炎、抗病毒和抗氧化活性。臨床試驗也評估了中醫中藥在治療H1N1引起的SP中的潛在益處。使用中藥治療H1N1引起的SP是一種有前景的治療方法。

復方芩蘭口服液，具有辛涼解表之功效，研究已經證實其對冠狀病毒肺炎有治療作用［11］。本研究通過H1N1感染構建SP小鼠模型，并通過HE染色驗證了建模結果，建模后使用復方芩蘭口服液灌胃小鼠，結果顯示干預后小鼠的肺指數和肺損傷程度得到了顯著的緩解，并且可以明顯地抑制血清炎性細胞因子的水平。

復方芩蘭口服液由金銀花、黃芩、連翹、板藍根等藥物組成，研究顯示金銀花不但具有抗病毒的作用［12］，還可以直接抑制氧化應激引起的炎性反應［13］。以黃芩、連翹為主要成分的中藥均可以明顯地緩解感染造成的肺損傷［14］。現代中藥藥理學分析表明，連翹和板藍根在呼吸道病毒感染的治療中具有重要作用［15］。這提示對于H1N1感染引起的SP小鼠，復方芩蘭口服液可以顯著地緩解炎性反應，并保護肺組織。

在病毒感染的早期通常不給予抗病毒藥物，而宿主免疫反應是治療流感的重要手段，病毒會激活機體的細胞免疫，輕微的炎性反應有助于宿主對病毒的吞噬和清除。若發生大量病毒感染，則會引起過度的炎性反應，激活并引起“細胞因子風暴”，這不但會直接引起肺組織的損傷，引起炎性浸潤［16］。Th17/Treg的失衡在過度炎性反應中發揮重要作用。研究顯示，病毒感染會直接激活NF-κB通路，而NF-κB通路的激活會促進淋巴細胞向Th17分化并抑制向Treg分化，誘導Th17分泌大量的促炎因子加劇肺損傷［10］。

本研究結果顯示，復方芩蘭口服液可以顯著抑制Th17水平并促進Treg的分化，使Th17/Treg向Treg偏移。此外，復方芩蘭口服液也會明顯抑制淋巴細胞中NF-κB通路中NF-κB和RelB mRNA和蛋白的表達水平。有研究［17］顯示，金銀花提取物具有抗氧化和抗炎活性，從而保護胃黏膜。研究表明，復方芩蘭口服液中活性物質具有調控NF-κB信號的作用；金銀花提取物可以通過抑制BV-2小膠質細胞中的NF-κB信號傳導，從而抑制脂多糖刺激的炎癥反應［18］。而黃芩活性物質不但可以抑制肺泡上皮細胞中的NF-κB通路，緩解LPS誘導的促炎反應［19-20］，還可以調控過敏性哮喘小鼠Th17/Treg的平衡，緩解肺部癥狀［21］。這提示復方芩蘭口服液中的活性物質可以通過抑制NF-κB通路并調節RORγt和FOXP3的轉錄水平，進而調控淋巴細胞分化，使Th17/Treg平衡向Treg偏移，進而抑制免疫炎性反應，緩解肺損傷。

綜上所述，復方芩蘭口服液可以通過抑制NF-кB通路誘導Treg而抑制Th17，從而調節免疫炎性反應，緩解由流感病毒引起的SP。關于復方芩蘭口服液治療流感病毒引起的SP仍需要臨床實驗證實，其中的有效化合物和作用機制值得深入探究。