魚腥草發酵工藝條件的優化研究

陳佩瑤，姜立春，胡榆琳，趙秋月

（綿陽師范學院，四川綿陽 621000）

魚腥草（英文名：Herba Houttuyniae）是三白草科植物蕺菜屬植物蕺菜（拉丁學名：Houttuynia cordataThunb.）的干燥地上部分及新鮮全草[1]。藥理試驗表明，魚腥草具有抗菌[2]、抗炎[3-6]、抗過敏、鎮痛和止血等功效。從魚腥草中提取出的黃酮能清除體內自由基，被用來治療心血管疾病。

本試驗旨在通過利用單因素及響應面分析，探究料液比、接種量、發酵時間及發酵溫度對魚腥草發酵提取總黃酮得率的影響，為提高魚腥草發酵液中黃酮含量提供新的研究方向和思路，以期為魚腥草發酵產業的發展提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

魚腥草（購于綿陽永興康貝大藥房）。

1.2 試劑

酵母菌（安琪酵母股份有限公司）、果膠酶（和氏璧生物科技有限公司）、蛋白酶（和氏璧生物科技有限公司）、纖維素酶（和氏璧生物科技有限公司）、蘆丁（上海如吉生物科技對照品專用）、蛋白胨（OXOID LTD）、酵母浸粉（OXOID LTD）等。

1.3 儀器設備

DZTW型電熱套、LKTC-B1型水浴鍋、SC-3610型低速離心機、MS-3020型自控高壓消毒鍋、BCD-216E/B型低溫冰箱、SW-CJ-1FD型超凈工作臺、DHP-600型電熱恒溫干燥培養箱

1.4 試驗方法

1.4.1 魚腥草發酵工藝

將魚腥草莖段切成1 cm小段，浸泡于蒸餾水中，漂洗3次后瀝干，40 ℃烘箱中干燥至恒重后粉碎2次，5 min/次，過40目篩。根據一定料液比配制成魚腥草懸浮液，在40 ℃水浴溫度下浸提3 h，浸提后加入50 ℃水浴鍋中用一定的酶進行酶解3 h，將酶解后的魚腥草溶液調pH至4左右，105 ℃，滅菌30 min。冷卻后的魚腥草溶液接種一定量的活化酵母，在一定培養溫度下，恒溫培養一定時間，發酵結束取濾液待測。

1.4.2 黃酮標準曲線的制作

盧丁標準溶液。于100 mL容量瓶中加入10 mg蘆丁對照品、10 mL甲醇，待對照品溶解后，用蒸餾水定容，搖勻，制成0.1 mg/mL的盧丁標準溶液。利用可見分光光度計，波長510 nm處測定吸光值。以葡萄糖標準溶液濃度為橫坐標，以吸光度值為縱坐標進行線性回歸，得到標準曲線方程為：y=0.790 4x，R2=0.992 1。根據R2=0.992 1可知，黃酮標準曲線的線性關系良好。

1.4.3 單因素試驗

單因素試驗考察了料液比、接種量、發酵時間、發酵溫度和酶解時酶種類5個因素對黃酮提取率的影響。料液比分別為1∶12、1∶16、1∶20、1∶24和1∶28，酵母菌接種量分別為0.5%、1%、2%、4%和6%，發酵時間分別為3 d、5 d、7 d、9 d和11 d，發酵溫度分別為23 ℃、26 ℃、29 ℃、32 ℃和35 ℃，酶解時酶種類分別為果膠酶、果膠酶+蛋白酶、果膠酶+纖維素酶和果膠酶+纖維素酶+蛋白酶。

1.4.4 分析方法

（1）總黃酮含量的測定。采用紫外分光光度法測定樣品中的總黃酮含量[7]。

（2）數據分析。采用Excel2019和Design-Expert8.0.6Trial軟件進行數據統計及分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 料液比對魚腥草發酵結果的影響

根據1.4.1方法，分析料液比對魚腥草發酵結果的影響，結果如圖1所示。隨著料液比的增加，黃酮含量先升高后下降，在料液比為1∶24時，黃酮含量達到峰值，黃酮含量為0.091 mg/mL，此時發酵效果最好。

圖1 料液比對魚腥草發酵結果的影響

2.1.2 接種量對魚腥草發酵結果的影響

根據1.4.1方法，分析接種量對魚腥草發酵結果的影響，結果如圖2所示。隨著酵母菌接種量的增加，總黃酮含量先緩慢增加，再緩慢減少，最終趨于平穩；當酵母菌接種量為4%時，總黃酮含量最高，為0.08 mg/mL。

圖2 菌種接種量對魚腥草發酵結果的影響

2.1.3 發酵時間對魚腥草發酵結果的影響

根據1.4.1方法，分析發酵時間對魚腥草發酵結果的影響，結果如圖3所示。隨著發酵時間的增加，黃酮含量先緩慢增加后緩慢減少。當培養天數為7 d時，總黃酮含量達到峰值，為0.091 mg/mL。

圖3 發酵時間對魚腥草發酵結果的影響

2.1.4 發酵溫度對魚腥草發酵結果的影響

根據1.4.1方法，分析發酵溫度對魚腥草發酵結果的影響，結果如圖4所示。隨著發酵溫度的升高，總黃酮含量先緩慢增加后緩慢減少。當發酵溫度為29 ℃時，總黃酮含量最高，為0.086 mg/mL。

圖4 發酵溫度對魚腥草發酵結果的影響

2.1.5 酶解菌種對魚腥草發酵結果的影響

根據1.4.1方法，分析酶解菌種對魚腥草發酵結果的影響，結果如圖5所示（A為果膠酶，B為蛋白酶，C為纖維素酶）。當酶種為A+B+C時，總黃酮含量達到峰值，為0.082 mg/mL。

圖5 酶解種類不同對魚腥草發酵結果的影響

2.2 響應面試驗設計及最優條件的確定[8-9]

根據單因素試驗結果，利用響應面對魚腥草發酵條件進一步優化，分別選取A料液比、B接種量、C發酵時間、D發酵溫度，設計4因素3水平的響應面試驗，以總黃酮得率作為考察指標，試驗設計及結果如表1所示。

表1 響應面試驗設計及結果

利用軟件對試驗數據進行分析得到以黃酮為響應值的回歸 線 方 程 為：Y=0.089+3.250×10-3×A+3.147×10-3×B+3.500×10-3×C+3.000×10-3×D+7.500×10-4×AB+7.500×10-4×AC+1.750×10-3×AD-1.250×10-3×BC+2.500×10-3×BD+5.000×10-4×CD-8.683×10-3×A2-6.433×10-3×B2-9.808×10-3×C2-7.558×10-3×D2（R2=0.941 0，P＜ 0.000 1）。

由表2可知，回歸方程的P＜0.000 1，說明該回歸方程模擬效果極顯著，失擬項P=0.376 5＞0.05，說明失擬項檢驗不顯著，回歸方程模型擬合度高，試驗誤差對試驗結果干擾性較低。R2=0.941 0，說明響應面的理論值和實際值呈較為顯著的相關性。此外，模型A、B、C、D對黃酮得率的影響極顯著（P＜0.01）。從F值的大小可以看出，發酵條件的4個因素對魚腥草發酵的影響大小為：C發酵時間＞B接種量＞A料液比＞D發酵溫度。

表2 回歸模型方差分析

利用Design-Expert軟件繪制料液比、接種量、發酵時間以及發酵溫度4個因素之間的交互作用對總黃酮得率的響應面，結果如圖6所示。

圖6反映了料液比、接種量、發酵時間、發酵溫度4個因素之間兩兩交互作用對黃酮提取率的影響。從響應曲面圖中可以看出，各個因素在試驗設定的參數范圍內都存在最高點，說明試驗設定參數合理。結合表2可以得出，AB、AC、AD、BC、BD、CD兩兩交互作用對黃酮得率影響不顯著（P＞ 0.05）。

圖6 各因素對發酵樣品中黃酮得率影響的響應曲面圖

2.3 黃酮最優提取條件驗證試驗

綜合響應面結果分析出的魚腥草發酵總黃酮得率最優條件為料液比為1∶24.47；接種量為6.31%；發酵時間為7.18 d；發酵溫度為29.56 ℃，此時魚腥草發酵黃酮含量值為0.091 mg/mL。為驗證試驗結果的真實性，且從實際情況出發，將魚腥草的發酵工藝參數調整為：料液比為1∶25；接種量為6%；發酵時間為7 d；發酵溫度為30 ℃，在此試驗條件下進行3次驗證試驗，得出黃酮提取率平均值為（0.095±0.004） mg/mL，與響應面分析得到的預測值基本符合，因此該響應面模型優化的黃酮提取率可靠性較高。

3 結論

本研究以魚腥草為原料，以黃酮含量作為試驗指標，選取料液比、接種量、發酵時間和發酵溫度作為影響因子，利用單因素試驗探究對魚腥草發酵產黃酮的影響，再利用響應面分析影響因子之間的交互作用及最佳發酵工藝條件，研究結果表明：影響作用：發酵時間＞接種量＞料液比＞發酵溫度；發酵優化條件為料液比1∶25，接種量6%，發酵時間7 d，發酵溫度30 ℃，在此條件下，魚腥草發酵提取到的黃酮得率的平均值為（0.095±0.004） mg/mL，說明響應面模型可靠性高。