HPLC-MS/MS檢測茶葉中草甘膦及其代謝物氨甲基膦酸和草銨膦殘留

石雪芬，石美蓮

（深圳信測標準技術服務有限公司，廣東深圳 518000）

隨著全球范圍的百草枯禁限用不斷加大，草銨膦繼草甘膦之后，成長為第二大除草劑，近年來市場比重加大。草甘膦和草銨膦屬于滅生性除草劑，有廣譜、低毒、高效等綜合性質，被廣泛施用于果園，其殘留問題越來越受到關注。目前關于草甘膦和草銨膦毒性問題存在爭議，但由于兩者農藥使用范圍廣，用量大，不排除通過食物鏈對動物及人體產生潛在毒性。《食品安全國家標準 食品中農藥最大殘留限量》（GB 2763—2021）規定了茶葉中草銨膦和草甘膦的限量[1]。

草甘膦及產物氨甲基膦酸和草銨膦常用的檢測方法有分光光度法、電感耦合等離子光譜法（ICP）、色譜法（IC、LC、GC）、質譜法（LC-MS/MS、GC-MS），然而氣質法需衍生氣化后才能用，過程繁瑣。液相色譜紫外法基質較復雜，定性難度大，而LC-MS/MS具有較高的選擇性和靈敏度[2]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試劑

茶葉，購自農貿市場；氯甲酸-9-芴基甲酯，純度99.0%；乙腈、甲酸、乙酸銨，均為色譜純試劑；標準物質（草甘膦 100 μg/mL，k=2，3%；氨甲基膦酸 100 μg/mL，k=2，3%；草銨膦100 μg/mL，k=2，3%。A Chemtek Inc.標準物質草甘膦-13C215N 99.9 μg/mL，k=2，3%），購自壇墨質檢科技股份有限公司。

1.1.2 儀器

液相色譜-質譜聯用儀，SCIEX TRIPLE QUAD?4500；萬分之一電子天平，上海精其FA2204N；多管渦旋混旋儀，上海精其LF-200；臺式離心機，凱特TD5；數顯恒溫水浴鍋，DK-S24；水浴恒溫振蕩器，HA2A。

1.2 溶液的配制

①硼酸鈉溶液（50.0 g/L，pH=9）。稱取5 g硼酸鈉，用水溶解并定容至100 mL。②氯甲酸-9-芴基甲酯乙腈溶液（FMOC-Cl）。稱取1 g氯甲酸-9-芴基甲酯，用乙腈溶解并定容至100 mL。③乙酸銨溶液（0.1%甲酸溶液）。稱取0.154 g乙酸銨溶于適量水中，用水定容1 000 mL后加入甲酸1 mL。

1.3 樣品的提取、凈化和衍生。

①精密稱取茶葉（1±0.01）g，置于離心管中，加入1 μg/mL的內標0.20 mL和10 mL 0.05 mol/L NaOH溶液，渦旋混勻40 ℃水浴振蕩提取20 min，離心后取2 mL上清液于裝有50 mg PSA的10 mL離心管中凈化，再取凈化試液1.0 mL至離心管中，加入0.2 mL的硼酸鈉溶液，搖勻后再加入0.2 mL FMOC-Cl衍生試劑，渦旋混勻振搖后置于40 ℃衍生4 h，離心后過水系濾膜，供液質分析，同時做空白試驗。②分別配制濃度為1～80 ng/mL，且內標濃度為10 ng/mL的混標，各取1 mL，衍生與樣品同法操作[3]。

1.4 儀器設備及參數信息

1.4.1 色譜條件

儀器型號：SCIEX TRIPLE QUAD? 4500；色譜柱信息：Agilen（tUSDAY64791）；類型：ZORBAX SB-C18；規格：2.1 mm×50 mm，1.8 μm；流動相：A為乙腈，B為2 mmol/L乙酸銨（0.1%甲酸溶液）；流速：0.35 mL/min；進樣量：5 μL；柱溫：40 ℃；梯度：0.3～3.0 min，90%的A保持1 min；2～3 min A相降低至10%；3.1 min A相升高至90%并保持2 min至5 min結束。

1.4.2 質譜條件

離子源：ESI+源；模式：正模式；掃描模式為MRM；離子源溫度500 ℃，離子源氣壓50 psi；離子噴霧電壓5 500 V；氣簾氣25 psi；碰撞氣8 psi，衍生物參數見表1。

表1 衍生物參數

2 結果與分析

2.1 草甘膦含量的計算

草甘膦的含量是以草甘膦及其代謝物氨甲基磷酸之和計，若以草甘膦表示則需換算，查資料可知草甘膦的分子量為169.07，氨甲基磷酸的分子量為111.04，氨甲基磷酸換算為草甘膦的系數為0.656 8；即以草甘膦表示的結果計算公式為：草甘膦的含量+氨甲基磷酸的含量 ×0.656 8。

2.2 方法的線性、檢出限及定量限

標準系列濃度為1 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL和80 ng/mL，驗證正確度和精密度時，3水平濃度平行取樣測定6次。結果見表2。

表2 方法的線性、檢出限及定量限

2.3 流動相的優化

試驗表明，流動相優化包括乙腈-水、乙腈-2mmol/L甲酸銨、乙腈-2mmol/L甲酸銨（0.1%甲酸）、乙腈-5mmol/L甲酸銨（0.1%甲酸）。結果表明，采用乙腈-2mmol/L甲酸銨（0.1%甲酸）作為流動相，緩沖體系更穩定，能提高目標化合物離子化效率，化合物分離度和靈敏度都達到最佳[4]。

2.4 提取劑的優化及凈化材料的選取

草甘膦及代謝物氨甲基磷酸和草銨膦均是強極性化合物，難溶于丙酮、二氯甲烷等有機溶劑。試驗選取乙腈（0.1%甲酸）、pH=6.0的水溶液、0.05 mol/L NaOH溶液等作為提取溶劑茶葉中的3種目標分析物進行提取。同時對比了不同的凈化材料，如C18、CAX固相萃取柱、50 mg PSA、100 mg PSA、二氯甲烷試劑，綜合考慮成本、提取效率等因素，最終采用0.05 mol/L NaOH溶液等作為提取溶劑，50 mg PSA作為凈化材料提取目標分析物效果最好[5]。

2.5 衍生劑時間的優化

草甘膦及代謝物氨甲基磷酸和草銨膦分子量較小，直接檢測信號不強。而在堿性環境（pH=9）下，通過FOMC-基團取代目標化合物氮原子上的氫，生成較穩定的化合物FOMC-R。在茶葉基質中添加過量衍生試劑條件下，對衍生反應時間（1 h、2 h、4 h、6 h、8 h和24 h）進行優化，結果表明在40 ℃，pH=9時衍生反應4 h后，測得衍生化合物含量無明顯增加，確認了最佳的衍生時間，結果見圖1。

圖1 不同時間衍生結果的趨勢圖

3 結論

本方法研究同時檢測茶葉中草甘膦及其代謝物氨甲基磷酸和草銨膦殘留，優化了色譜條件的前處理條件，從農貿市場隨機采購了茶葉，采用0.05 mol/L NaOH溶液等作為提取溶劑，50 mg PSA作為凈化材料提取，加標濃度為0.01～0.60 mg/kg，精密度為1.03%～2.36%，回收率為81.8%～107.2%，得到較為滿意的測試方法，過程高效，簡單快速，可用于大批量樣品的快速檢測。