山芹菜中總黃酮的提取工藝優(yōu)化

楊宇婷

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，吉林長春 130000）

山芹菜的根呈圓錐形，有分支，黃褐色，為傘形科大葉芹屬植物[1-2]。山芹菜可用作食用也可用作藥膳。山芹菜外皮呈紫紅色，表面有比較深的紋絡(luò)，主要在5—6月份采集[3]，其根部較粗壯，莖部相對短，須根暗褐色。山芹菜益處極多，味道甘涼且具有調(diào)經(jīng)消炎，降壓鎮(zhèn)熱和清熱止咳等功效，可清理胃中濕濁[4-5]。山芹菜同時具有清熱、利水消腫、止血止帶[6-7]、降血壓、降血糖、抗炎、抗動脈硬化等重要的藥用價值[8]。

自21世紀(jì)以來，總黃酮一直備受人們關(guān)注與研究，人們發(fā)現(xiàn)其具有維生素C樣的活性[9]，研究發(fā)現(xiàn)，總黃酮均有不同程度的抗氧化作用，總黃酮在某種程度上也具有清除自由基等生物性高活性[10]。在營養(yǎng)學(xué)和科學(xué)界備受關(guān)注。總黃酮有2-苯基色原酮結(jié)構(gòu)使其具有多種生物活性[11]，可抗衰老等[12]。總黃酮其抗氧化性主要體現(xiàn)在減少自由基和清除自由基，山芹菜中的總黃酮成分有利于自身營養(yǎng)需求的選擇。本實驗通過改變提取過程中的參數(shù)使其得率提高，為山芹菜資源的開發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山芹菜，來自吉林省雙陽區(qū)郊區(qū)；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品純度，上海嵐派生物技術(shù)有限公司；無水乙醇，陜西西安天茂化工有限公司；亞硝酸鈉，天津市鼎盛鑫化工有限公司；硝酸鋁，廣州省廣州市錦源化學(xué)有限公司；甲醇，廣州省廣州市錦源化學(xué)有限公司；氫氧化鈉，陜西省西安天茂化工有限公司，以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

電子分析天平（型號：JY5002，上海滬瑞明儀器有限公司）；數(shù)顯恒溫水浴鍋（型號：HH-6，常州朗越儀器制造有限公司）；粉碎機（型號：M150A，中山市雕牌電器有限公司）；超聲波清洗機（型號：SB-800D，寧波新芝生物科技有限公司）；循環(huán)式水式多用真空泵（型號：SHB-III，鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；紫外分光光度計（型號：UV-1240，上海島津?qū)嶒炂鞑挠邢薰荆缓銣馗稍锵洌ㄐ吞枺篏ZX-9146MB，上海博迅科技有限公司）

1.3 實驗方法

1.3.1 工藝流程

山芹菜中總黃酮的提取工藝流程見圖1。

圖1 工藝流程圖

1.3.2 操作要點

①山芹菜的選取。選取新鮮，無蟲蛀、無損壞的山芹菜的莖葉進行研究。②烘干。采用電熱鼓風(fēng)干燥箱105 ℃干燥。③總黃酮的提取。取烘干后的山芹菜，用粉碎機粉碎后過100目篩，然后稱取山芹菜的粉末2 g放于燒杯內(nèi)，同時加入40 mL左右的合適濃度乙醇，進行浸提。超聲功率選擇100 W，處理一段時間，處理完成后用布氏漏斗對其進行抽濾2次，合并抽濾液，再用與浸提乙醇濃度相同的乙醇稀釋至刻度15 mL，得到樣品液，備用。

1.3.3 山芹菜中總黃酮提取量的測定及得率計算

（1）繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線。稱量2 mg蘆丁放到燒杯中備用，保證蘆丁干燥，加入濃度70%的乙醇對蘆丁進行溶解，定容至10 mL，得到0.2 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液。吸取0 mL、0.50 mL、1.50 mL、2.00 mL和2.50 mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液，加入0.3 mL 5%的亞硝酸鈉，搖勻后放置6 min；加入4%的氫氧化鈉溶液6 mL，靜置10 min；加入10%的硝酸鋁0.3 mL，靜置6 min，加乙醇稀釋至刻度。乙醇作為空白試劑，在510 nm處測量吸光度，得到回歸方程。

（2）總黃酮得率的計算。取山芹菜樣品稀釋液照上述方法操作，對山芹菜提取液進行吸光度測試[9]，代入式（1），計算得山芹菜黃酮得率[10]。

式中：C為山芹菜總黃酮提取樣品的質(zhì)量濃度，mg/mL；V為山芹菜總黃酮樣液的總體積，mL；M為山芹菜質(zhì)量，g。

1.4 單因素實驗

在控制其他因素不變的前提下，分別設(shè)置乙醇濃度梯度（50%、60%、70%、80%和90%）、料液比梯度（1∶5、1∶10、1∶ 15、1∶ 20和1∶25）、超聲溫度（40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃ 和 80 ℃）、 超 聲 時 間（40 min、50 min、60 min、70 min和80 min）進行單因素試驗，測定山芹菜樣液樣品吸光度值，計算山芹菜總黃酮樣品總黃酮得率。

1.5 正交實驗設(shè)計

在單因素實驗結(jié)果基礎(chǔ)上，通過正交試驗不斷地改進提取工藝，以乙醇濃度、料液比、超聲溫度、超聲時間等4個變量為主要的實驗因素[11-12]，進行4因素3水平正交實驗。以山芹菜總黃酮提取率進行判斷，從而確定最佳的提取工藝條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖2可知，橫坐標(biāo)表示樣品的吸光度值，縱坐標(biāo)表示溶液濃度，得到蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為：Y=0.349 2x+0.007，R2=0.996 4

圖2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 單因素實驗結(jié)果與分析

2.2.1 不同乙醇濃度對山芹菜總黃酮得率的影響

由圖3可知，當(dāng)乙醇濃度在50%～70%時，山芹菜總黃酮得率呈增長趨勢，當(dāng)乙醇濃度達到70%時，可以看出此時總黃酮得率最大，乙醇的濃度過高則會破壞提取液中溶質(zhì)細胞壁，超過70%即實驗山芹菜總黃酮得率呈下降趨勢。因此最佳的乙醇的濃度應(yīng)為60%、70%、80%作為正交實驗3個水平。

圖3 乙醇濃度對總黃酮得率的影響

2.2.2 不同料液比對山芹菜總黃酮得率的影響

由圖4可知，當(dāng)料液比在1∶5～1∶15時，山芹菜的總黃酮得率呈上升趨勢，當(dāng)料液比在1∶15時達到最大值，當(dāng)料液比＞1∶15時山芹菜總黃酮得率逐漸下降，所以選擇1∶10、1∶15、1∶20這3個料液比作為最佳的正交試驗水平。

圖4 料液比對總黃酮得率的影響

2.2.3 超聲溫度對山芹菜總黃酮得率的影響

由圖5可知，當(dāng)溫度在40～60 ℃時，山芹菜總黃酮得率呈上升趨勢，這表明在這個溫度區(qū)間內(nèi)，溫度越高，總黃酮的得率越大。但當(dāng)超聲溫度超過60 ℃時，山芹菜總黃酮得率不再增加且出現(xiàn)下降的現(xiàn)象，隨著溫度的不斷增大，有大分子的物質(zhì)溶解出來，故而生物的活性成分會遭受到破壞。故選擇50 ℃、60 ℃、70 ℃這3個超聲溫度作為正交實驗3個水平。

圖5 提取溫度對總黃酮得率的影響

2.2.4 超聲時間對山芹菜總黃酮得率的影響

由圖6可知，當(dāng)超聲時間在30～70 min時，山芹菜總黃酮得率呈上升趨勢，但超過70 min后可以看出總黃酮的得率開始下降。而隨著提取時間的延長，不斷地有一些雜質(zhì)溶出，影響實驗結(jié)果。所以應(yīng)選擇60 min、70 min、80 min這3個最佳超聲時間作為正交實驗3個水平。

圖6 超聲時間對總黃酮得率的影響

2.3 正交試驗結(jié)果分析

在單因素實驗的基礎(chǔ)上進行正交實驗，選擇乙醇濃度、料液比、超聲時間、超聲溫度4個因素，正交試驗因素水平見表1，正交試驗結(jié)果見表2。山芹菜總黃酮化合物得率的影響因素大小關(guān)系B＞C＞A＞D，本研究的提取條件是：A1B2C2D2，與K、k最優(yōu)組合A2B2C2D2不符合，對此進行驗證性實驗。

表1 正交試驗因素水平表

表2 正交試驗結(jié)果表

2.4 驗證性實驗及結(jié)果分析

正交試驗中結(jié)果顯示山芹菜的總黃酮得率最高實驗組與K值分析的實驗組不同，故對正交試驗中A1B2C2D2和A2B2C2D2進行驗證性實驗。A2B2C2D2所測得山芹菜總黃酮的得率最高，最優(yōu)的料液比為1∶15，超聲溫度60 ℃、70%濃度的乙醇、70 min的提取時間，最佳工藝條件下，山芹菜總黃酮得率1.368%。

3 結(jié)論

本實驗研究了超聲波輔助法對于山芹菜中總黃酮提取的優(yōu)化方案，實驗采用了單因素和正交，最終確定的最優(yōu)條件是：以70%濃度的乙醇作為提取劑、料液比1∶15（g∶mL）、超聲溫度60 ℃、超聲時間70 min，得到總黃酮得率為1.368%。