川楝素對(duì)胃癌細(xì)胞糖酵解效應(yīng)的影響及相關(guān)機(jī)制

李錫丁，周永平，李旻昊，范新奇

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬無錫第二醫(yī)院 1.普外科； 2. 肝膽外科，江蘇 無錫 214002)

川楝素是從傳統(tǒng)中藥楝屬植物川楝子和苦楝皮中提取出的一種四環(huán)三萜類化合物，具有良好的抗腫瘤作用，是一種極具潛力的抗癌藥物[1]。既往文獻(xiàn)表明川楝素可抑制胃癌細(xì)胞的惡性表型，并促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡[2-3]。惡性腫瘤是一種以逃避細(xì)胞增殖檢查點(diǎn)為特征的疾病。即使在氧氣存在的情況下，癌細(xì)胞也可將葡萄糖代謝重新編程為有氧糖酵解方式，以替代常規(guī)的氧化磷酸化途徑來供給能量[4]。腫瘤細(xì)胞常通過調(diào)控葡萄糖攝取、乳酸生成和ATP合成等代謝方式，發(fā)揮其增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和逃逸等惡性潛能，有助于其在腫瘤進(jìn)展期間無限地增殖和存活[5-6]。研究提示，胃癌細(xì)胞在惡性轉(zhuǎn)化的過程中，細(xì)胞的代謝模式會(huì)從氧化磷酸化轉(zhuǎn)化為有氧糖酵解以滿足更多的能量需求[7]。

線粒體NAD依賴性脫乙酰酶Sirtuin-3(SIRT3)是一種腫瘤抑制因子，是有氧糖酵解的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，可通過缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor-1α, HIF-1α)抑制糖酵解效應(yīng)，進(jìn)而抑制葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1 (glucose transporter 1，GLUT1)和乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase A，LDHA)等糖酵解關(guān)鍵調(diào)控因子的表達(dá)，抑制腫瘤的惡性生物學(xué)行為[8]。信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3 (signal transducer and activator of transcription 3, STAT3)是一種具有促癌功能的轉(zhuǎn)錄因子。研究表明，STAT3/SIRT3/HIF-1α信號(hào)軸在卵巢癌細(xì)胞的增殖和糖代謝重塑等惡性表型中可發(fā)揮重要調(diào)控作用[9]。既往有研究報(bào)道，STAT3是川楝素的潛在作用靶點(diǎn)[10]。為探究川楝素是否通過STAT3/SIRT3/HIF-1α信號(hào)軸抑制腫瘤細(xì)胞糖酵解效應(yīng)，本研究擬從糖代謝角度探討川楝素對(duì)胃癌細(xì)胞中糖酵解效應(yīng)的影響，及其對(duì)STAT3/SIRT3/HIF-1α信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用。

1 材料和方法

1.1 組織標(biāo)本、細(xì)胞及主要試劑

收集2020年4月至10月在南京醫(yī)科大學(xué)附屬無錫第二醫(yī)院通過手術(shù)切除的31例胃癌患者的石蠟包埋胃癌組織切取片。所有患者術(shù)前均未曾接受任何治療，術(shù)后通過病理診斷證實(shí)為胃腺癌。

胃癌AGS和HGC-27細(xì)胞購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫(北京)。根據(jù)既往文獻(xiàn)報(bào)道[11]購買同一批次川楝素，購自武漢ChemFaces公司。將川楝素溶于二甲基亞砜中，制成10 mol/L溶液，于-20 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩Ｆ咸烟俏蘸腿樗嵘煞治鲈噭┖芯鶠槊绹鳥iovision公司產(chǎn)品；pRL-TK、pGL3-control 載體、雙熒光素酶檢測試劑盒為美國Promega公司產(chǎn)品；LipofectamineTM轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司；pcDNA3.1(+)質(zhì)粒和pcDNA3.1(+)-STAT3質(zhì)粒購自蘇州泓迅生物科技有限公司，并經(jīng)測序證實(shí)；大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自天根生化科技有限公司；STAT3(人抗兔單抗)、SIRT3 (人抗兔多抗)和HIF-1α (人抗兔單抗)一抗均為英國Abcam公司產(chǎn)品；DAB染色液、二抗試劑盒和抗原修復(fù)液購自福州邁新生物開發(fā)有限公司；總RNA抽提、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)試劑盒購自北京天根生化科技公司。

1.2 免疫組織化學(xué)法檢測SIRT3、STAT3和HIF-1α表達(dá)

將甲醛固定和石蠟包埋的標(biāo)本行5 μm切片。經(jīng)二甲苯浸泡10 min脫蠟、無水乙醇浸泡5 min、95%乙醇浸泡5 min和70%乙醇浸泡5 min水化。隨后分別用0.3%過氧化氫和10 %正常山羊血清封閉15 min，蒸餾水搖洗3遍(3 min/次)。在沸水中加入EDTA(pH 8.0)枸櫞酸鈉緩沖溶液(pH 6.0)浸泡5 min后使用高壓熱修復(fù)10 min。切片與抗體(STAT3 1 ∶1 000，SIRT3 1 ∶500，HIF-1α 1 ∶100)孵育過夜；用0.01 mol/L PBS徹底洗滌。加入相應(yīng)的鼠抗兔二抗工作液，室溫孵育30 min。以不加一抗、不加二抗以及一抗和二抗均不加作為陰性對(duì)照。最后用DAB染色，鏡下控制顯色，保證顯色時(shí)間基本一致。切片浸入自來水中終止顯色反應(yīng)，蘇木精復(fù)染15 s，自來水沖洗返藍(lán)30 min，脫水封片。免疫組化切片經(jīng)3D HISTECH數(shù)字切片掃描系統(tǒng)(匈牙利3D HISTECH公司)掃描后，采用3D HISTECH定量Center2.1分析軟件計(jì)算棕色區(qū)域(陽性區(qū)域)和藍(lán)色區(qū)域(陰性區(qū)域)的面積和灰度值，通過總灰度值計(jì)算積分光密度值(integral optical density，IOD)，最后將IOD除以圖片陽性面積得到最終指標(biāo)平均光密度值(mean optical density, MOD)[11]。

1.3 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 胃癌AGS和HGC-27細(xì)胞復(fù)蘇后以2×106/mL密度接種在25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，置于37 ℃和5 % CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；細(xì)胞隔天換液至生長達(dá)80%～90%時(shí)，用0.1%胰酶消化并傳代，選取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞設(shè)立溶劑對(duì)照組和2個(gè)不同濃度的川楝素處理組。分別給予DMSO、100 nmol/L川楝素和250 nmol/L川楝素處理24 h[12]，藥物濃度經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定有效。

1.3.2 葡萄糖和乳酸水平檢測 用BioProfile FLEX分析儀(美國諾華生物醫(yī)學(xué))和乳酸試劑盒測量培養(yǎng)基中的葡萄糖和乳酸水平，并將其標(biāo)準(zhǔn)化為細(xì)胞數(shù)。在新鮮培養(yǎng)基中加入細(xì)胞孵育30～60 min，測量培養(yǎng)基中乳酸鹽水平(乳酸鹽試劑盒)，并將其標(biāo)準(zhǔn)化為每個(gè)細(xì)胞的數(shù)量。

1.3.3 qRT-PCR檢測GLUT1mRNA和LDHAmRNA表達(dá) 抽提胃癌細(xì)胞內(nèi)總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行qRT-PCR。STAT3上游引物：5′-GGAGGAGGCATTCGGAAAG-3′，下游引物：5′-TCGTTGGTGTCACACAGAT-3；SIRT3上游引物：5′-CCATCGGAAGGACTAGGTGTCT-3′，下游引物：5′-GGCTTGGGGTTGTGAAAGAAG-3′；HIF-1α上游引物：5′-TCGTTGGTGTCACACAGAT-3′，下游引物：5′-CCATCGGAAGGACTAGGTGTCT-3′。GLUT1上游引物：5′-AACTC TTCAGCCAGGGTCCA-3′，下游引物：5′-CACAGTGAAGATGATGAAGAC-3′；LDHA上游引物：5′-GGAGATTCCAGTGTGCCTGT-3′，下游引物：5′-GTCCAATAGCCCAGGATGTG-3′；β-肌動(dòng)蛋白上游引物：5′-AGAGCTACGAGCTGCCTGAC-3′，下游引物：5′-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3′，引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。20 μL反應(yīng)體系包含：Master混合物10 μL，酶混合物1 μL，上游引物 1 μL，下游引物 1 μL，探針1 μL，RNA模板6 μL。擴(kuò)增條件：50 ℃逆轉(zhuǎn)錄30 min，95 ℃初始化15 min，94 ℃變性1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30～35個(gè)循環(huán)，72 ℃ 10 min。反應(yīng)完成后首先查看每個(gè)基因的熔解曲線是否為單峰和擴(kuò)增情況，導(dǎo)出相應(yīng)的閾值循環(huán)數(shù)(Ct值)，采用2-△△Ct法計(jì)算實(shí)驗(yàn)組(川楝素處理)與對(duì)照組(DMSO處理)之間基因表達(dá)量的差異。

1.3.4 熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)測定SIRT3啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性 從http://dbtss.hgc.jp網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫檢索獲得SIRT3啟動(dòng)子序列的-2000～+100部分序列，設(shè)計(jì)啟動(dòng)子引物序列，并在上游引物5′端加入KpnⅠ酶切位點(diǎn)GGTACC，在下游引物5′端加入HindⅢ酶切位點(diǎn)AAGCTT。

收集對(duì)數(shù)生長期HGC-27細(xì)胞約1×107個(gè)，DNA提取試劑盒提取基因組DNA。以HGC-27細(xì)胞基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增獲得SIRT3啟動(dòng)子條帶，參照試劑盒的操作說明回收并純化。將SIRT3的人啟動(dòng)子序列作為pGL3-SIRT3-promoter插入pGL3-基本載體中。在鋪有AGS和HGC-27細(xì)胞的6孔板中轉(zhuǎn)染pGL3-SIRT3質(zhì)粒(100 ng)和Renilla對(duì)照質(zhì)粒(5 ng)。將細(xì)胞分為3組，2個(gè)川楝素處理組和對(duì)照組，分別加入250 nmol/L川楝素、250 nmol/L川楝素和等體積DMSO溶劑。其中一組川楝素處理細(xì)胞轉(zhuǎn)染STAT3過表達(dá)質(zhì)粒(5 ng)。在轉(zhuǎn)染后48 h采用雙熒光素酶測定試劑盒檢測熒光素酶活性。報(bào)告熒光素酶活性基于海腎熒光素酶標(biāo)準(zhǔn)化，然后重新調(diào)整為單位等于1的載體對(duì)照信號(hào)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 STAT3/SIRT3/HIF-1α信號(hào)軸蛋白在胃癌組織中的表達(dá)

免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，在胃癌組織中，可觀察到STAT3和HIF-1α蛋白在腫瘤細(xì)胞核中整體表現(xiàn)為陽性或強(qiáng)陽性，而SIRT3在腫瘤細(xì)胞核中整體表現(xiàn)為陽性或弱陽性(圖1)。

分析三者表達(dá)的MOD值，結(jié)果顯示，SIRT3免疫染色表達(dá)與STAT3 (r=-0.425，P=0.017)和HIF-1α (r=-0.513，P=0.003)呈負(fù)相關(guān)，而STAT3和HIF-1α (r=0.598，P=0.001)的免疫染色表達(dá)呈正相關(guān)。見圖2。

圖1 免疫組織化學(xué)法檢測胃癌組織中SIRT3、STAT3和HIF-1α蛋白表達(dá)(×100)

圖2 胃癌組織中SIRT3、STAT3和HIF-1α蛋白表達(dá)的相關(guān)性分析

2.2 川楝素對(duì)胃癌細(xì)胞糖酵解效應(yīng)的影響

與對(duì)照組比較，100 nmol/L、250 nmol/L川楝素作用于AGS和HGC-27 細(xì)胞后，胃癌細(xì)胞葡萄糖相對(duì)吸收值和相對(duì)乳酸生成量明顯降低(P均<0.01)。與100 nmol/L川楝素處理組比較，250 nmol/L川楝素處理組胃癌AGS和HGC-27 細(xì)胞葡萄糖相對(duì)吸收值和相對(duì)乳酸生成量明顯降低(P均<0.01)。見圖3。

a：P<0.01，與對(duì)照組比較；b：P<0.01，與100 nmol/L川楝素比較

2.3 川楝素對(duì)胃癌細(xì)胞GLUT1和LDHA mRNA表達(dá)的影響

結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，100 nmol/L、250 nmol/L川楝素組AGS、HGC-27胃癌細(xì)胞GLUT1mRNA和LDHAmRNA表達(dá)明顯降低(P<0.05或<0.01)。與100 nmol/L川楝素組比較，250 nmol/L川楝素組AGS、HGC-27胃癌細(xì)胞GLUT1、LDHAmRNA表達(dá)明顯降低(P均<0.01)。見圖4。

a：P<0.05，與對(duì)照組比較；b：P<0.01，與100 nmol/L川楝素比較

2.4 川楝素對(duì)胃癌細(xì)胞STAT3、SIRT3和HIF-1α mRNA表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比，100 nmol/L、250 nmol/L川楝素組AGS和HGC-27胃癌細(xì)胞STAT3、HIF-1αmRNA表達(dá)明顯降低(P均<0.01)，SIRT3mRNA表達(dá)明顯增強(qiáng)(P均<0.01)。與100 nmol/L川楝素處理組比較，250 nmol/L川楝素處理組胃癌細(xì)胞STAT3和HIF-1αmRNA表達(dá)明顯降低(P均<0.01)，SIRT3mRNA表達(dá)明顯增強(qiáng)(P均<0.01)。見圖5。

a：P<0.01，與對(duì)照組比較；b： P<0.01，與100 nmol/L川楝素比較

2.5 川楝素通過抑制STAT3來上調(diào)SIRT3啟動(dòng)子活性

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，高濃度川楝素(250 nmol/L)在胃癌細(xì)胞中的調(diào)控作用更顯著，所以本實(shí)驗(yàn)選用高濃度川楝素處理細(xì)胞。結(jié)果顯示，川楝素處理明顯升高AGS和HGC-27細(xì)胞中SIRT3啟動(dòng)子誘導(dǎo)的熒光素酶活性(P<均0.01)；而在川楝素處理的AGS和HGC-27細(xì)胞中導(dǎo)入STAT3質(zhì)粒，與川楝素處理組比較，過表達(dá)STAT3則可從一定程度降低川楝素對(duì)SIRT3啟動(dòng)子誘導(dǎo)的熒光素酶活性的促進(jìn)作用(P均<0.01)。見圖6。

a：P<0.01，與對(duì)照組比較；b：P<0.01，與250 nmol/L川楝素比較

3 討論

HIF-1α是控制糖酵解基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，而線粒體NAD依賴性脫乙酰酶SIRT3是一種腫瘤抑制因子，SIRT3作為Warburg效應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，通過使HIF-1α不穩(wěn)定來介導(dǎo)代謝重編程，進(jìn)而調(diào)控GLUT1和LDHA等糖酵解關(guān)鍵調(diào)控因子表達(dá)，抑制腫瘤的惡性生物學(xué)行為[8]。本研究檢測發(fā)現(xiàn)STAT3、SIRT3和HIF-1α蛋白均在胃癌組織中表達(dá)，而且SIRT3蛋白表達(dá)與STAT3和HIF-1α表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，STAT3和HIF-1α蛋白表達(dá)呈中度相關(guān)，提示STAT3/SIRT3/HIF-1α信號(hào)通路可能參與胃癌細(xì)胞糖代謝的調(diào)控。

根據(jù)既往文獻(xiàn)報(bào)道[12]，本研究中分別選用低濃度100 nmol/L和高濃度250 nmol/L的川楝素處理胃癌細(xì)胞。選用兩株胃癌細(xì)胞(AGS細(xì)胞和HGC-27細(xì)胞)，以證實(shí)相關(guān)影響在胃癌細(xì)胞中的普遍性。結(jié)果顯示，川楝素均可抑制葡萄糖攝取和乳酸生成，抑制糖酵解關(guān)鍵調(diào)控因子GLUT1mRNA和LDHAmRNA表達(dá)，高濃度川楝素可獲得更強(qiáng)的抑制效果。由此提示，川楝素可呈一定濃度依賴性降低胃癌細(xì)胞中的糖酵解水平。

既往研究表明，川楝素可通過調(diào)節(jié)具有促癌功能的轉(zhuǎn)錄因子STAT3實(shí)現(xiàn)抗腫瘤抑制作用[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，川楝素可以抑制STAT3和HIF-1αmRNA表達(dá)，促進(jìn)SIRT3mRNA表達(dá)，且川楝素濃度越高調(diào)控效果越強(qiáng)。利用川楝素處理胃癌細(xì)胞，可促進(jìn)SIRT3啟動(dòng)子的活化，但在川楝素處理的胃癌細(xì)胞中過表達(dá)STAT3則可以部分削弱川楝素的作用。由此表明，川楝素通過上調(diào)SIRT3啟動(dòng)子活性促進(jìn)SIRT3轉(zhuǎn)錄表達(dá)；過表達(dá)STAT3可以抑制川楝素對(duì)SIRT3啟動(dòng)子的活化作用。

綜上所述，川楝素可通過介導(dǎo)STAT3表達(dá)影響SIRT3/HIF-1α調(diào)控軸，繼而抑制胃癌細(xì)胞糖代謝水平。但是，川楝素是否通過糖代謝相關(guān)分子途徑影響胃癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移和凋亡等惡性表型，需要進(jìn)一步探討。