環(huán)狀RNA hsa_circ_0079557在胃癌中的表達(dá)及其臨床意義

袁海濤， 周曉東， 張垚， 陳正威， 步雪峰

(江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院普外科，江蘇 鎮(zhèn)江 212002)

由于胃癌缺乏早期診斷靶點(diǎn)及其發(fā)生發(fā)展復(fù)雜的異質(zhì)性[1-2]，部分胃癌患者確診時(shí)已經(jīng)失去了最佳手術(shù)時(shí)期。胃癌發(fā)生、擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移過(guò)程除了與幽門(mén)螺桿菌感染、肥胖、過(guò)量攝入鹽和硝酸鹽以及A型血有關(guān)，還與基因突變、表觀遺傳學(xué)改變和異常分子信號(hào)通路等其他因素相關(guān)[3-4]。

環(huán)狀RNA(circular RNA，circRNA)是一類(lèi)內(nèi)源性非編碼RNA，存在于大多數(shù)生物體內(nèi)[5]，主要是通過(guò)直接反向剪接或外顯子跳躍生成共價(jià)閉合環(huán)的機(jī)制形成，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。研究表明，環(huán)狀RNA不是剪接錯(cuò)誤的副產(chǎn)品，環(huán)狀RNA表達(dá)異?？赡苌婕盎蚺c蛋白調(diào)控[6]。環(huán)狀RNA還與胃癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程有關(guān)[7]，其可作為多種腫瘤早期風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估、臨床治療和生存評(píng)估的生物標(biāo)志物[8]，而高通量測(cè)序技術(shù)發(fā)展和普及更是加快了環(huán)狀RNA研究進(jìn)展。早在2017年Chen等[9]發(fā)現(xiàn)，環(huán)狀RNA在胃癌組織和血清中表達(dá)水平差異可能與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程以及TNM分期密切相關(guān)，但環(huán)狀RNA對(duì)胃癌細(xì)胞增殖遷移等能力影響尚不清楚。因此，本研究利用高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)5對(duì)人胃癌組織中環(huán)狀RNA表達(dá)譜，進(jìn)行生物信息學(xué)分析得到目的環(huán)狀RNA hsa_circ_0079557，檢測(cè)其在胃癌患者組織、血清和胃癌、胃黏膜上皮細(xì)胞的差異性表達(dá)，并利用siRNA沉默hsa_circ_0079557后進(jìn)行細(xì)胞生物功能學(xué)實(shí)驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 病例

選擇2017年3月至2019年3月在江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院普外科接受根治性手術(shù)治療的原發(fā)性胃癌患者67例(含測(cè)序送檢標(biāo)本5例)，年齡29～87歲，中位年齡60歲；取胃癌組織與癌旁組織(距離癌組織>5.0 cm)后，加入RNA固定劑于-80 ℃保存?zhèn)溆?。所有患者術(shù)前均未接受放療或化療。另收集同期20例在江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院普外科接受胃癌根治術(shù)患者的術(shù)前和術(shù)后外周血及20例在門(mén)診體檢健康者外周血各5 mL，均于清晨空腹抽取肘正中靜脈血，術(shù)后采血時(shí)間為術(shù)后1周。血標(biāo)本均在取血當(dāng)日行2 000 r/min室溫離心，取上層血清500 μL，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩１狙芯拷?jīng)江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有檢測(cè)樣本在采集前均獲得受試者的知情同意。

1.2 細(xì)胞株與主要試劑

人胃癌SGC-7901、BGC-823、HGC-27、MGC-803細(xì)胞株均購(gòu)自南京凱基生物有限公司；人胃黏膜上皮GES-1細(xì)胞(美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù))。

Trizol、Trizol LS試劑和qRT-PCR相關(guān)的逆轉(zhuǎn)錄及擴(kuò)增試劑盒均為日本TaKaRa公司產(chǎn)品；胎牛血清、RPMI 1640均為美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品；脂質(zhì)體Lipofectamine 2000(美國(guó)Invitrogen公司)；siRNA引物設(shè)計(jì)和合成由廣州銳博生物科技有限公司制作；qRT-PCR相關(guān)引物(上海生工生物工程股份有限公司)；BCA蛋白定量試劑盒、細(xì)胞流式試劑盒均為南京福麥斯生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；兔抗人一抗細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶3(CDK3)抗體、二抗HRP羊抗兔抗體均為武漢博士德生物工程有限公司產(chǎn)品。

1.3 高通量測(cè)序技術(shù)和分析

5對(duì)胃癌及癌旁組織經(jīng)上海歐易生物公司采用第二代測(cè)序等技術(shù)檢測(cè)，預(yù)測(cè)結(jié)果含在circbase數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.circbase.org/)以及檢測(cè)到已知或新預(yù)測(cè)的部分環(huán)狀RNA，10個(gè)樣本的讀計(jì)數(shù)均使用DE-Seq軟件進(jìn)行歸一化處理。計(jì)算結(jié)果折變，進(jìn)行差異顯著性分析。選擇在組織中檢測(cè)結(jié)果為基因序列長(zhǎng)度<1 000、差異倍數(shù)>2和表達(dá)量高的環(huán)狀RNA，經(jīng)對(duì)比之后選擇hsa_circ_0079557作為分析與研究的對(duì)象。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)

胃癌SGC-7901、BGC-823、HGC-27、MGC-803細(xì)胞株和胃黏膜上皮GES-1細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清、雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)基中，置于37 ℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.5 RNA提取和qRT-PCR檢測(cè)hsa_circ_0079557相對(duì)表達(dá)量

采用Trizol試劑提取胃癌及癌旁組織、胃癌及胃黏膜上皮細(xì)胞中總RNA，采用Trizol LS試劑提取胃癌患者術(shù)前和術(shù)后血清及健康體檢者血清中總RNA，采用Nanodrop2000微量分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA濃度和純度后，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒步驟進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。取cDNA等試劑按照試劑盒說(shuō)明書(shū)配置20 μL反應(yīng)體系，包括8.2 μL DEPC水、10 μL SYBR Premix ExTaqⅡ和上、下游引物各0.4 μL 、1 μL cDNA加入8連管中。qRT-PCR條件：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃5 s，55 ℃退火30 s，40個(gè)循環(huán)。獨(dú)立樣本均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，hsa_circ_0079557上游引物為5′-GGTTGCAATGCTGCATTC-3′，下游引物為5′-GCTCCACAATGGATTTGGT-3′，以GAPDH和U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。根據(jù)qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果，取hsa_circ_0079557相對(duì)表達(dá)量的中位數(shù)作為分界值，將胃癌組織分為hsa_circ_0079557高、低表達(dá)組。并根據(jù)其在胃癌細(xì)胞株和胃黏膜上皮細(xì)胞中qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果選擇相對(duì)表達(dá)量較高的兩株胃癌細(xì)胞(HGC-27、MGC-803)作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株。

1.6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

細(xì)胞分為siRNA組和si-NC組，分別轉(zhuǎn)染siRNA和含無(wú)義序列siRNA片段的空白對(duì)照。每孔加入適量完全培養(yǎng)基，分別在每塊板中接種HGC-27、MGC-803細(xì)胞，每孔5×105個(gè)，培養(yǎng)12 h左右；取EP管，每管加入100 μL無(wú)血清培養(yǎng)基，再加入2 μL Lipofectamine 2000并輕輕混勻配置成a液；取無(wú)菌EP管，每管加入100 μL無(wú)血清培養(yǎng)基，再加入2 μL siRNA或空白對(duì)照，混勻配置成b液；將a、b液混合，室溫放置20 min形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物；當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)30%～50%時(shí)，每孔加入200 μL轉(zhuǎn)染復(fù)合物，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。qRT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率，方法同“1.5”。siRNA靶序列為GGAAGTCTGACTCTATCAA、si-NC靶序列為GACTCAGGTACGGAGACCA。

1.7 細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)胃癌細(xì)胞增殖水平

取“1.6”轉(zhuǎn)染后細(xì)胞，按照每孔5×102個(gè)細(xì)胞密度接種于6孔板，培養(yǎng)2周。用PBS清洗后，每孔加入1 mL多聚甲醛，4 ℃固定0.5 h；PBS緩緩清洗3次，每孔加入1 mL結(jié)晶紫常溫染色15 min，流水清洗至背景干凈，靜置干燥。計(jì)數(shù)細(xì)胞克隆數(shù)，克隆形成率(%)=(克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù))×100%。

1.8 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)胃癌細(xì)胞遷移水平

取“1.6”轉(zhuǎn)染后細(xì)胞，每孔1×105個(gè)細(xì)胞種于6孔板，加入無(wú)血清培養(yǎng)基，放置細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞單層貼壁達(dá)90%時(shí)，取無(wú)菌10 μL槍頭沿直線每孔劃2條線，PBS清洗3次，洗去脫落的細(xì)胞，分別于劃痕后0 h、24 h用顯微鏡觀察拍照。用Image J軟件計(jì)算細(xì)胞遷移率，細(xì)胞遷移率(%)=(0 h寬度-24 h寬度)/0 h寬度×100%。

1.9 蛋白免疫印跡法檢測(cè)胃癌細(xì)胞株中CDK3蛋白表達(dá)水平

取“1.6”轉(zhuǎn)染后細(xì)胞，PBS沖洗3次，每孔加入1 mL RIPA裂解液，冰上裂解15 min，用刮子沿12孔板孔壁反復(fù)刮取，吸入1 mL EP管中，100 ℃煮沸5 min；4 000 r/min離心5 min，取上清液。按照BCA蛋白定量試劑盒操作步驟測(cè)定蛋白濃度，按體積3 ∶1加入配制好的4×上樣緩沖液。

配制10% SDS-PAGE凝膠，80 V電泳30 min，110 V電泳60 min，將總蛋白按分子大小分離；350 mA 110 min，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜；牛血清白蛋白常溫封閉1 h；加入兔抗人CDK3抗體和兔抗人β-肌動(dòng)蛋白抗體，均1 ∶1 000稀釋?zhuān)? ℃孵育過(guò)夜；TBST洗滌3次；加入二抗HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG常溫孵育4 h；TBST洗滌3次；加入增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光顯影試劑曝光，用Image J軟件計(jì)算條帶灰度值。

1.10 流式細(xì)胞周期分析

收集12孔板中MGC-803細(xì)胞培養(yǎng)液，胰酶消化，1 200 r/min離心5 min，取沉淀細(xì)胞；加入1 mL預(yù)冷PBS，重懸細(xì)胞，1 200 r/min離心細(xì)胞，重復(fù)2次；取4 mL預(yù)冷95%乙醇，渦旋振蕩逐滴加入1 mL細(xì)胞懸液，4 ℃固定4 h；1 200 r/min離心5 min，取沉淀細(xì)胞；加入預(yù)冷的5 mL PBS，重懸細(xì)胞并經(jīng)1 200 r/min離心5 min。每個(gè)樣本中加入0.4 mL碘化丙啶染色液，緩慢并充分重懸細(xì)胞，37 ℃避光溫浴30 min。用CytoFLEX流式細(xì)胞儀在激發(fā)波長(zhǎng)488 nm處檢測(cè)紅色熒光，同時(shí)檢測(cè)光散射情況。用Flowjo分析軟件進(jìn)行細(xì)胞DNA含量分析和光散射分析。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 胃癌組織的環(huán)狀RNA譜

高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)5例胃癌組織標(biāo)本后得到73個(gè)環(huán)狀RNA，繪制成熱圖(圖1)。選擇其中差異較明顯的hsa_circ_0079557作為后續(xù)分析和研究對(duì)象。

圖1 胃癌組織中環(huán)狀RNA熱圖

2.2 hsa_circ_0079557在胃癌和癌旁組織中表達(dá)及其與胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系

由圖2可見(jiàn)，hsa_circ_0079557在胃癌組織中的表達(dá)水平顯著高于癌旁組織(t=2.374，P<0.05)。如表1所示，hsa_circ_0079557高表達(dá)與腫瘤分期顯著相關(guān)(P<0.01)，而與其他臨床病理相關(guān)參數(shù)無(wú)明顯相關(guān)性(P均>0.05)。

圖2 hsa_circ_0079557在胃癌組織和癌旁組織中的相對(duì)表達(dá)量(n=62)

2.3 hsa_circ_0079557在胃癌患者血清中表達(dá)

結(jié)果顯示，胃癌患者血清中hsa_circ_0079557表達(dá)水平明顯高于健康體檢者(t=4.481，P<0.01)；胃癌患者術(shù)前血清中hsa_circ_0079557表達(dá)量顯著高于術(shù)后(t=3.092，P<0.01)，見(jiàn)圖3。

表1 胃癌組織hsa_circ_0079557表達(dá)與臨床病理特征關(guān)系

圖3 胃癌患者血清中hsa_circ_0079557相對(duì)表達(dá)水平(n=20)

2.4 hsa_circ_0079557在胃癌細(xì)胞株中表達(dá)

結(jié)果顯示，hsa_circ_0079557在胃癌SGC-7901、BGC-823、HGC-27、MGC-803細(xì)胞株中表達(dá)量均明顯高于胃黏膜上皮GES-1細(xì)胞(P<0.05或<0.01)，而在不同胃癌細(xì)胞株中，HGC-27、MGC-803細(xì)胞中hsa_circ_0079557相對(duì)表達(dá)較高。見(jiàn)圖4。故后續(xù)以這兩種細(xì)胞株進(jìn)行轉(zhuǎn)染與生物功能學(xué)實(shí)驗(yàn)。

在HGC-27、MGC-803細(xì)胞中，siRNA組中hsa_ circ_ 0079557表達(dá)明顯低于si-NC組(t=16.860，5.115，P<0.01或<0.05)，見(jiàn)圖5。

a：P<0.05，b：P<0.01，與GES-1細(xì)胞相比

圖5 siRNA敲減后hsa_circ_0079557在胃癌細(xì)胞系的相對(duì)表達(dá)量

2.5 hsa_circ_0079557促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖和部分胃癌細(xì)胞遷移能力的改變

如圖6所示，在HGC-27和MGC-803細(xì)胞中，siRNA組細(xì)胞克隆形成率明顯低于si-NC組(t=3.578，4.021，P均<0.05)。如圖7所示，在MGC-803細(xì)胞中，si-NC組遷移率明顯高于siRNA組(t=4.033，P<0.05)，在HGC-27細(xì)胞中，si-NC組遷移率高于siRNA組，但差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由此表明，經(jīng)siRNA敲減hsa_circ_0079557后胃癌細(xì)胞增殖下降，部分胃癌細(xì)胞遷移能力下降。

圖6 不同胃癌細(xì)胞的細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

圖7 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同胃癌細(xì)胞的遷移率

2.6 hsa_circ_0079557促進(jìn)胃癌MGC-803細(xì)胞周期改變

如圖8所示，在MGC-803細(xì)胞中，siRNA組G0-G1期細(xì)胞分布明顯高于si-NC組(t=4.153，P<0.05)，siRNA組G2-M期和S期細(xì)胞分布明顯低于si-NC組(t=4.028，3.687，P均<0.05)。由此表明，經(jīng)siRNA敲減hsa_circ_0079557后，處于分裂期的細(xì)胞減少，細(xì)胞多阻滯于G0-G1期，hsa_circ_0079557促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)展。

圖8 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)敲減hsa_circ_0079557胃癌細(xì)胞周期

2.7 胃癌細(xì)胞株中CDK3蛋白表達(dá)

在胃癌HGC-27、MGC-803細(xì)胞中，si-NC組CDK3蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯高于siRNA組(t=3.215，4.376，P均<0.05)。見(jiàn)圖9。

圖9 蛋白免疫印跡檢測(cè)敲減hsa_circ_0079557胃癌細(xì)胞中CDK3表達(dá)

3 討論

以往研究發(fā)現(xiàn)，部分環(huán)狀RNA與胃癌細(xì)胞增殖等功能改變有關(guān)[10]，但大部分研究的目的環(huán)狀RNA來(lái)自circbase等數(shù)據(jù)庫(kù)。本研究利用高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)胃癌組織和癌旁組織，發(fā)現(xiàn)部分差異表達(dá)的環(huán)狀RNA，得到新的環(huán)狀RNA hsa_circ_0079557。利用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)62對(duì)標(biāo)本發(fā)現(xiàn)，hsa_circ_0079557在胃癌組織中的表達(dá)水平顯著高于癌旁組織，這與測(cè)序結(jié)果相符；且hsa_circ_0079557高表達(dá)與胃癌TNM分期顯著相關(guān)；此外，hsa_circ_0079557在胃癌患者血清中的表達(dá)高于健康體檢者，在胃癌患者術(shù)前血清中表達(dá)高于術(shù)后。由此表明，hsa_circ_0079557在胃癌組織以及胃癌患者血清中呈高表達(dá)，其在胃癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中可能起促癌作用。

Guo等[11]發(fā)現(xiàn)環(huán)狀RNA廣泛在結(jié)直腸中表達(dá)，其中hsa_circ_0000069在結(jié)直腸癌中表達(dá)上調(diào)，用siRNA進(jìn)行敲減，可以降低直腸癌細(xì)胞增殖與侵襲能力。Lasda等[12]也發(fā)現(xiàn)下調(diào)的circPVRL3可促進(jìn)胃癌MGC-803細(xì)胞增殖和遷移。本研究利用siRNA干擾環(huán)狀RNA hsa_circ_0079557表達(dá)，結(jié)果顯示siRNA組胃癌MGC-803和HGC-27細(xì)胞增殖能力下降，同時(shí)胃癌MGC-803遷移能力下降，但siRNA組HGC-27細(xì)胞遷移能力改變不明顯；在流式細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)中，siRNA組處于分裂期的MGC-803細(xì)胞較空白對(duì)照組少，細(xì)胞多阻滯于G0-G1期。由此說(shuō)明，沉默hsa_circ_0079557降低胃癌細(xì)胞增殖能力和部分胃癌細(xì)胞的遷移能力，可能具有胃癌臨床治療價(jià)值；而細(xì)胞增殖能力降低可能與細(xì)胞周期的改變有關(guān)，但為何沉默HGC-27細(xì)胞中hsa_circ_0079557表達(dá)對(duì)其細(xì)胞遷移能力改變不明顯尚未可知，有待進(jìn)一步研究。

近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)狀RNA可以通過(guò)環(huán)狀RNA-miRNA-mRNA之間的相互調(diào)節(jié)，競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合共同的miRNA反應(yīng)元件，實(shí)現(xiàn)多個(gè)RNA與多個(gè)靶基因之間的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，是目前關(guān)于環(huán)狀RNA等非編碼RNA研究中最重要的作用機(jī)制[13-14]。本研究分析預(yù)測(cè)hsa_circ_0079557可能影響的miRNA靶點(diǎn)及其對(duì)應(yīng)結(jié)合的蛋白，其中包含CDK3蛋白。CDK系列蛋白是細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制的核心，CDK系列蛋白原是細(xì)胞周期中的限速蛋白，其中，CDK3影響細(xì)胞從G0向G1期和G1向S期的轉(zhuǎn)變[15]。蛋白印跡檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，hsa_circ_0079557敲減后胃癌細(xì)胞中CDK3蛋白含量下降，其可能是導(dǎo)致胃癌細(xì)胞周期改變的關(guān)鍵因素。

綜上所述，本研究表明hsa_circ_0079557影響胃癌細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期進(jìn)展，這可能與hsa_circ_0079557通過(guò)調(diào)控靶蛋白CDK3有關(guān)，且hsa_circ_0079557影響部分胃癌細(xì)胞的遷移能力，對(duì)胃癌HGC-27細(xì)胞的遷移影響不明顯，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。