膿毒癥患者T淋巴細胞亞群水平與炎癥狀態動態變化的關系及對預后的影響▲

黃鑫波 劉端繪 莫旻龍 陳澤宇 明 靜 王勇湘

(廣西梧州市紅十字會醫院重癥醫學科，梧州市 543002，電子郵箱：stars-002@163.com)

膿毒癥是指感染誘發宿主免疫反應失衡導致危及生命的器官功能障礙[1]。目前膿毒癥的致病機制尚未被完全闡明，大多數學者認為系統性炎癥反應綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)與代償性抗炎反應綜合征(compensatory anti-inflammatory response syndrome，CARS)之間的失衡導致機體發生免疫功能紊亂可加重膿毒癥的病情[2]。既往認為膿毒癥患者早期免疫以SIRS為主，后期出現CARS或免疫抑制，但最新的研究顯示在膿毒癥病程中二者并存，共同作用導致機體免疫失衡[3-4]。SIRS診斷依據包含體溫、呼吸頻率、心率、外周血白細胞計數四項指標[5]，這些指標在臨床上容易獲得并且易發現有無異常，能較為靈敏地反映機體是否存在炎癥狀態。T淋巴細胞與機體炎癥狀態、免疫調節密切相關，參與SIRS的發生、發展過程[6]。目前關于膿毒癥患者T淋巴細胞亞群與炎癥狀態動態變化的研究仍較少，二者對于膿毒癥患者預后的影響仍不明確。本研究探討膿毒癥病程中T淋巴細胞亞群與炎癥指標的水平動態變化，分析兩者的相關性及對預后的影響，為復雜的膿毒癥免疫治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2017年6月至2020年6月我院ICU收治的106例膿毒癥患者作為觀察組，男性65例，女性41例，年齡35～85(62.36±11.19)歲；感染部位：肺部感染51例、顱內感染15例、尿路感染18例、膽管感染14例、腸道感染8例。納入標準：(1)均符合2016年膿毒癥3.0國際共識診斷標準[1]；(2)年齡>18歲。排除標準：(1)存在自身免疫性疾病或免疫缺陷性疾病；(2)近6個月使用過類固醇激素或免疫抑制劑；(3)惡性腫瘤、血液系統疾病患者；(4)ICU住院時間不足24 h者；(5)家屬不愿配合治療者。另選取同期在我院體檢的40例健康志愿者作為對照組，男性25例，女性15例，年齡39～80(59.16±10.09)歲。納入標準：年齡>18歲，無嚴重慢性疾病、無自身免疫病及腫瘤病史，近6個月無使用類固醇激素或免疫抑制劑史。兩組患者的性別、年齡等一般資料比較，差異均無統計學意義(均P>0.05)，具有可比性。本研究經本院醫學倫理委員會同意，且研究對象及家屬均簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 資料收集與檢測方法：收集健康對照組體檢當天與觀察組患者入院后第1天、第4天、第7天的空腹外周靜脈血T淋巴細胞亞群(CD4+、CD8+、CD4+/CD8+)、白細胞計數、血清C反應蛋白(C-reactive protein，CRP)、血清降鈣素原、血清內毒素水平，以及體溫、呼吸頻率、心率、急性生理與慢性健康評價系統Ⅱ(Acute Physiology and Chronic Health Evaluation Ⅱ，APACHEⅡ)評分。每次均采集血液標本6 mL，分成2份，一份于4℃下以1 000 r/min離心10 min，收集血清置于-20℃冰箱中保存待測；采用流式細胞計數法檢測全血白細胞計數，采用免疫比濁法檢測血清CRP水平，采用電化學發光法檢測血清降鈣素原水平，采用酶促凝集系統透光度測定法檢測血清內毒素水平。另一份使用Ficoll密度梯度離心法分離單個核細胞，采用美國Beckman公司Navios流式細胞儀檢測全血T淋巴細胞亞群(CD4+、CD8+、CD4+/CD8+)水平。所有實驗室操作均按照試劑說明書及標準規范執行。

1.2.2 治療方法：觀察組患者入院后均按《2016年膿毒癥與膿毒癥休克國際診療指南》[7]進行液體復蘇、抗感染、機械通氣、血液凈化、營養支持、血糖管理、調控血壓等治療。

1.3 統計學方法 采用SPSS 25.0軟件進行統計分析。正態分布計量資料以(x±s)表示，兩組間比較采用成組設計兩樣本t檢驗、重復測量資料比較采用重復測量方差分析，非正態分布計量資料采用M(P25，P75)表示，比較采用秩和檢驗；計數資料以例數和百分比(%)表示，比較采用χ2檢驗；采用Pearson檢驗分析T淋巴細胞亞群與炎癥指標、APACHEⅡ評分的關系。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 兩組研究對象觀察指標的比較 對照組患者入院第1天的外周血CD4+、CD4+/CD8+水平均高于觀察組，而體溫、心率、呼吸頻率、APACHEⅡ評分及外周血白細胞計數、血清CRP、血清降鈣素原、血清內毒素、外周血CD8+水平均低于觀察組(均P<0.05)。見表1。

表1 兩組研究對象觀察指標的比較

組別n白細胞計數(x±s,×109/L)CRP[M(P25,P75),mg/dL]降鈣素原[M(P25,P75),ng/mL]內毒素[M(P25,P75),EU/mL]APACHEⅡ評分[M(P25,P75),分]觀察組10615.85±7.6713.10(9.10,18.65)17.41(8.19,35.93)0.33(0.04,0.98)24.0(20.00,28.00)對照組405.84±1.30 0.30(0.10,0.50)0.03(0.01,0.05)0.03(0.02,0.04)3.0(2.00,5.00) t/z值11.820-8.258-8.274-5.762-8.221P值<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001

2.2 不同預后膿毒癥患者一般資料的比較 根據觀察組患者入院后28 d的預后情況分為存活組76例和死亡組30例。存活組患者與死亡組患者的年齡、性別及原發感染部位比較，差異均無統計學意義(均P>0.05)。見表2。

表2 存活組與死亡組膿毒癥患者一般資料的比較

2.3 不同預后膿毒癥患者T淋巴細胞亞群水平的比較 兩組患者的外周血CD4+、CD8+水平比較，差異均有統計學意義(F組間=4.643，P組間=0.034；F組間=17.841，P組間<0.001)，但兩組CD4+/CD8+比較，差異無統計學意義(F組間=2.918，P組間=0.091)；兩組外周血CD4+、CD8+、CD4+/CD8+水平均有隨時間變化的趨勢(F時間=8.267，P時間=0.001；F時間=6.663，P時間=0.002；F時間=3.633，P時間=0.031)；分組與時間均有交互效應(F交互=5.244，P交互=0.007；F交互=55.415，P交互<0.001；F交互=44.953，P交互<0.001)。其中，入院第7天，存活組的外周血CD4+、CD4+/CD8+水平均高于死亡組，外周血CD8+水平低于死亡組(均P<0.05)。見表3。

表3 不同預后膿毒癥患者T淋巴細胞亞群水平的比較

組別nCD4+/CD8+[M(P25,P75)]入院第1天入院第4天入院第7天存活組761.19(0.95,1.76)1.28(0.96,1.72)2.04(1.95,2.27)?死亡組301.29(0.86,1.70)1.17(0.71,2.15)0.86(0.65,1.09)?△

2.4 不同預后膿毒癥患者炎癥指標、生命體征及APACHEⅡ評分的比較 兩組患者的心率、呼吸頻率、APACHEⅡ評分及外周血白細胞計數、血清CRP、血清降鈣素原、血清內毒素水平比較，差異均有統計學意義(F組間=47.097、11.121、200.266、9.616、36.587、11.238、6.827，P組間<0.001、0.001、<0.001、0.003、<0.001、0.001、0.011)，而兩組的體溫比較，差異無統計學意義(F組間=1.129，P組間=0.291)；兩組的心率、呼吸頻率、APACHEⅡ評分及血清CRP、血清降鈣素原、血清內毒素水平均有隨時間變化的趨勢(F時間=4.268、5.894、78.765、11.759、12.945、18.874，P時間=0.017、0.004、<0.001、<0.001、<0.001、<0.001)，而兩組的體溫及外周血白細胞計數均無隨時間變化的趨勢(F時間=2.017、2.436，P時間=0.140、0.094)，分組與時間均無交互效應(F交互=2.724、1.273，P交互=0.072、0.285)。兩組患者心率、APACHEⅡ評分及血清CRP、血清降鈣素原、血清內毒素水平分組與時間有交互效應(F=12.484、32.352、15.931、4.202、30.058，P<0.001、<0.001、<0.001、0.018、<0.001)，但兩組患者呼吸頻率分組與時間無交互效應(F=0.924，P=0.401)。其中，入院后第4天及第7天，存活組患者的心率、呼吸頻率、APACHEⅡ評分及外周血白細胞計數、血清CRP、血清降鈣素原水平均低于死亡組，且入院后第1天存活組心率及APACHEⅡ評分，以及入院后第7天存活組患者的體溫及血清內毒素水平均低于死亡組(均P<0.05)。見表4。

表4 不同預后膿毒癥患者炎癥指標、生命體征及APACHEⅡ評分的比較

組別n呼吸頻率(x±s,次/min)入院第1天入院第4天入院第7天白細胞計數(x±s,×109/L)入院第1天入院第4天入院第7天存活組7625.44±7.4622.44±4.24?22.94±3.59?15.13±7.5413.25±5.94?12.03±4.11?死亡組3028.50±8.7226.67±4.99△26.27±5.02△17.26±7.8617.05±5.38△16.78±5.83△

組別nCRP(x±s,mg/dL)入院第1天入院第4天入院第7天降鈣素原[M(P25,P75),ng/mL]入院第1天入院第4天入院第7天存活組7613.97±10.258.94±4.32?5.97±3.44?20.64(12.67,29.33)9.64(2.10,15.65)?2.98(0.80,8.21)?死亡組3016.50±5.2716.74±6.97△17.01±5.68△24.78(12.28,46.58)23.47(10.47,37.34)△23.54(13.11,35.44)△

組別n內毒素[M(P25,P75),EU/mL]入院第1天入院第4天入院第7天APACHEⅡ評分(x±s,分)入院第1天入院第4天入院第7天存活組760.26(0.05,0.91)0.11(0.03,0.65)?0.03(0.02,0.10)?22.03±5.5112.69±4.33?7.86±3.46?死亡組300.37(0.04,1.20)0.07(0.02,0.59)?0.23(0.16,1.21)△28.80±7.39△23.63±6.46?△27.83±6.08△

2.5 膿毒癥患者T淋巴細胞亞群與炎癥指標、APACHEⅡ評分的相關性 膿毒癥患者的體溫、心率、呼吸頻率、APACHEⅡ評分及外周血白細胞計數、血清CRP、血清降鈣素原、血清內毒素水平與外周血CD4+、CD4+/CD8+水平均呈負相關，與外周血CD8+水平呈正相關(均P<0.05)。見表5。

表5 膿毒癥患者T淋巴細胞亞群水平與炎癥指標水平、APACHEⅡ評分的相關性

3 討 論

膿毒癥免疫失調的機制復雜，目前認為是由于病原微生物感染導致機體釋放炎癥介質誘發炎癥風暴所致。炎癥風暴會導致機體多臟器損傷，加重膿毒癥患者免疫功能紊亂，增加死亡率[8]。SIRS的診斷需滿足以下任意2個或2個以上條件[5]：(1)體溫>38℃或<36℃；(2)呼吸頻率>20次/min或動脈血二氧化碳分壓<32 mmHg；(3)心率>90次/min；(4)外周血白細胞計數>12×109/L或<4×109/L或未成熟中性粒細胞>10%。Jiang等[9]的薈萃分析發現，SIRS嚴重程度與感染患者的死亡風險呈正相關。CRP是由肝細胞分泌的急性時相蛋白，具有促炎和抗炎特性，CRP水平在感染發生后4～6 h內升高，約2 d達峰值，隨病情好轉而下降[10]。降鈣素原由甲狀腺C細胞分泌，為一種次級炎癥介質，其并非膿毒癥的啟動因子，具有促炎和誘導免疫抑制作用，降鈣素原水平在膿毒癥發生后2～4 h內迅速升高，約6 h達峰值，隨感染加重而上升，可作為感染早期敏感的生物標志物[11-12]。內毒素是革蘭氏陰性菌細胞壁的一種脂多糖，是人體極為敏感的“致熱源”，具有明確的致炎性，血液內毒素含量達100 ng即可激活炎癥反應，進而影響全身臟器功能，當機體發生革蘭氏陰性菌感染時內毒素大量釋放入血，激活單核巨噬細胞和中性粒細胞產生白細胞介素1β、白細胞介素6、腫瘤壞死因子α、一氧化氮、血小板激活因子等炎癥因子，誘發SIRS導致多臟器功能損傷[13-14]。Klein等[15]研究表明，膿毒癥伴高內毒素血癥患者的死亡率和多器官功能障礙發生率更高。因此，血清內毒素可作為感染的炎癥指標之一。APACHEⅡ評分由年齡、急性生理評分、慢性健康評分3部分組成，廣泛用于評估危重患者的病情和預后，分值越高提示病情越嚴重、預后越差。本研究結果顯示，觀察組患者入院第1天的外周血CD4+、CD4+/CD8+水平均低于對照組，而體溫、心率、呼吸頻率、APACHEⅡ評分及外周血白細胞計數、血清CRP、血清降鈣素原、血清內毒素、外周血CD8+水平均高于對照組(均P<0.05)，提示膿毒癥患者早期即存在免疫功能紊亂及全身性炎癥反應綜合征。本研究還觀察不同預后膿毒癥患者的炎性指標和APACHEⅡ評分的變化情況，結果顯示，存活組經治療后心率、呼吸頻率、APACHEⅡ評分及外周血白細胞計數、血清CRP、血清降鈣素原、血清內毒素水平逐漸下降，與治療第1天比較，治療第7天上述指標均明顯改善，治療第7天的體溫與第1天雖然無統計學差異，但也有所下降；死亡組治療第4天時，除體溫、血清CRP水平較第1天升高外，心率、呼吸頻率、APACHEⅡ評分及外周血白細胞計數、血清降鈣素原、血清內毒素水平均較第1天下降好轉，但至治療第7天時各項炎癥指標再次升高，且與第1天比較無統計學差異；而且治療第7天兩組患者各項炎癥指標和APACHEⅡ評分差異均有統計學意義(均P<0.05)，提示存活組患者經治療后高炎癥狀態逐漸好轉，預后較好，而死亡組患者仍處于持續高炎癥反應狀態，預后不佳。造成兩組患者各項炎癥指標變化趨勢不一致的原因除與兩組病情嚴重程度不同外，還應考慮與主動降溫、控制心率、機械通氣、血液凈化等治療措施有關。由此推測，膿毒癥患者全身炎癥反應程度重、持續時間長可能與患者預后不良有關。

研究發現，膿毒癥患者免疫抑制出現早且持續時間長，主要表現為淋巴細胞凋亡、機體易感性增加，相對于炎癥反應導致的感染，免疫抑制所致感染的死亡率更高[3-4，16]。T淋巴細胞是免疫功能的重要指標，監測T淋巴細胞的數量與功能可評估膿毒癥患者的預后[17]。CD4+、CD8+是T淋巴細胞重要的表面抗原標志物，CD4+T淋巴細胞的主要功能是協助發揮體液免疫及細胞免疫[18]，CD8+T淋巴細胞則發揮免疫耐受和細胞殺傷作用[19]，CD4+T淋巴細胞增殖或功能不良會使CD8+T淋巴細胞輔助能力減弱，導致細胞殺傷、溶解能力下降，出現免疫抑制[20]。因此，檢測CD4+、CD8+T淋巴細胞和CD4+/CD8+能有效地評估機體免疫狀態。本研究結果顯示，觀察組入院第1天的CD4+T淋巴細胞水平、CD4+/CD8+比值均低于對照組，CD8+T淋巴細胞水平高于對照組(均P<0.05)，提示膿毒癥患者在發病早期即存在免疫功能紊亂，出現免疫抑制。進一步觀察不同預后的膿毒癥患者T淋巴細胞亞群的動態變化，結果顯示，隨著治療時間的延長，存活組患者的CD4+T淋巴細胞水平逐漸升高，CD8+T淋巴細胞水平先升高后下降，CD4+/CD8+比值先下降后升高，且治療第7天與第1天比較，差異均有統計學意義(均P<0.05)；死亡組患者的CD4+、CD8+T淋巴細胞水平及CD4+/CD8+比值均先升高后下降，治療第7天與第1天比較，差異均有統計學意義(均P<0.05)；治療第7天，存活組的CD4+、CD4+/CD8+水平均高于死亡組，CD8+水平低于死亡組(均P<0.05)。由此可見，膿毒癥患者免疫功能改善可能預示預后良好。本研究Pearson相關分析結果顯示，膿毒癥患者的體溫、心率、呼吸頻率、APACHEⅡ評分及外周血白細胞計數、血清CRP、血清降鈣素原、血清內毒素水平與外周血CD4+、CD4+/CD8+水平均呈負相關，與外周血CD8+水平均呈正相關(均P<0.05)，這提示膿毒癥患者同時存在全身炎癥反應與免疫功能紊亂，二者相互影響導致病情加重，改善免疫功能異常可減輕全身炎癥損傷及改善預后。

綜上所述，膿毒癥患者發病早期即存在免疫功能紊亂及全身性炎癥反應綜合征，兩者共同影響疾病預后，動態監測T淋巴細胞亞群水平及全身炎癥狀態可評估膿毒癥患者的臨床診療效果及預后。但是本研究樣本量小，也沒有進一步監測其他炎癥指標及淋巴細胞亞群水平的變化，今后仍需要大樣本的隨機對照研究來論證本研究結論。