注射用神經(jīng)節(jié)苷脂鈉對癲癇持續(xù)狀態(tài)大鼠認知功能障礙及神經(jīng)炎癥的改善作用及機制▲

歐詒丹 陳 靜 高元杰

(海南省儋州市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，儋州市 571700，電子郵箱：flower1988@163.com)

癲癇是一種由大腦神經(jīng)元異常過度放電引起的反復(fù)發(fā)作的神經(jīng)系統(tǒng)疾病[1]。癲癇發(fā)作持續(xù)30 min以上，或在短時間內(nèi)頻繁發(fā)作而不能自止的狀態(tài)，稱為癲癇持續(xù)狀態(tài)[2]。若癲癇持續(xù)時間過長或多次反復(fù)發(fā)作，可造成不可逆的腦損傷，導(dǎo)致患者認知功能障礙[3]。丙戊酸鈉、卡馬西平和苯妥英鈉等是目前臨床常用的抗癲癇藥物，但仍有20%～30%的癲癇患者經(jīng)治療后還會頻繁發(fā)作并發(fā)展為難治性癲癇[4]。同時，常規(guī)抗癲癇藥物伴存在多種不良反應(yīng)，這些不良反應(yīng)也影響了患者服藥的依從性。因此，尋找療效較好且副作用小的抗癲癇藥物成為當前迫切需要解決的問題。神經(jīng)節(jié)苷脂鈉注射液為治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷性疾病的常用藥，癲癇持續(xù)狀態(tài)是造成患者神經(jīng)損傷的主要病因，神經(jīng)節(jié)苷脂鈉能夠穿透血腦屏障，有效促進神經(jīng)功能恢復(fù)[5-7]。近年來，大量研究顯示癲癇發(fā)作引起的神經(jīng)炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致腦組織病理改變以及認知功能損傷的重要原因[8-10]。Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)-髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)信號通路在癲癇發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用[9]，深入研究其與神經(jīng)炎癥及癲癇發(fā)作的關(guān)系，有利于進一步闡明癲癇發(fā)病的機制。本研究主要分析注射用神經(jīng)節(jié)苷脂鈉對氯化鋰-毛果蕓香堿誘導(dǎo)的癲癇持續(xù)狀態(tài)大鼠認知功能障礙及神經(jīng)炎癥的改善作用并基于TLR4-MyD88通路探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 試驗藥物及試劑 單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂鈉注射液(20 mg/支)購自北京賽升藥業(yè)股份有限公司(批號：20193881)；丙戊酸鈉片(500 mg/片)購自山東仁和堂藥業(yè)有限公司(批號：20200427)；氯化鋰(100 g/瓶)購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司(批號：310468)；鹽酸毛果蕓香堿(5 g/瓶)購自上海邁瑞爾化學(xué)技術(shù)有限公司(批號：1538901CAS)；溴甲基東莨菪堿(25 mg/瓶)購自上海禾豐制藥有限公司產(chǎn)品(批號：190213)；地西泮(2 mL/10 mg)購自上海旭東海普藥業(yè)有限公司(批號：190301)。Nissl染色試劑盒購自上海生工生物工程有限公司(批號：1922S04)；白細胞介素(interleukin，IL)-1β、IL-6、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)的酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒購自上海酶科(批號：20200125、20200311、20200214)；總蛋白提取試劑盒購自Sigma公司(批號：017K6145)，TLR-4抗體、核因子κB (nuclear factor κB，NF-κB)抗體、MyD88抗體、β-肌動蛋白抗體購自R&D公司(批號：220645、223712、220428、220635)，辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG二抗購自Abcam公司(批號：ab205811)。

1.2 主要儀器 WMT-100水迷宮視頻跟蹤分析系統(tǒng)(成都泰盟軟件有限公司)；RM 2235石蠟切片機(Leica公司);ChemTron KSW 光學(xué)顯微鏡(Leica公司)；RT-6500型酶標儀(深圳雷杜公司)；-80℃超低溫冰箱(SANYO公司)；電泳儀、凝膠成像儀(Bio-Rad公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗動物及分組：無特定病原體級雄性SD大鼠60只，體重(200±20) g，6～8周齡。大鼠購自海南藥物研究所有限責任公司[動物許可證號:SYXK(瓊)2020-0007]，飼養(yǎng)于20℃～25℃、相對濕度為50%～65%的環(huán)境中，實驗前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。稱大鼠體重后，將不同體重的大鼠采用隨機區(qū)組方法分為空白組、模型組、陽性對照組、神經(jīng)節(jié)苷脂鈉組，每組15只。

1.3.2 模型制備：采用腹腔注射氯化鋰-毛果蕓香堿建立癲癇大鼠模型[10]。取模型組、陽性對照組及神經(jīng)節(jié)苷脂鈉組大鼠，均先給予氯化鋰(127 mg/kg)腹腔注射，18～20 h后給予毛果蕓香堿(30 mg/kg)腹腔注射，注射毛果蕓香堿前30 min給予溴甲基東莨菪堿(1 mg/kg)腹腔注射以減輕膽堿能外周反應(yīng)。注射毛果蕓香堿后立即觀察各組大鼠的行為表現(xiàn)，根據(jù)Racine分級標準[11]判定大鼠是否出現(xiàn)癲癇發(fā)作。其中，正常狀態(tài)為0級；面部肌肉抽動痙攣為Ⅰ級；Ⅰ級+頸部肌肉痙攣為Ⅱ級；Ⅱ級+前肢痙攣為Ⅲ級；Ⅲ級+后肢站立為Ⅳ級；Ⅳ級+身體向后跌倒、四肢抽動為Ⅴ級。若癲癇未發(fā)作或發(fā)作未達到Ⅳ級，則每隔30 min腹腔注射毛果蕓香堿一次(10 mg/kg)，直至出現(xiàn)癲癇持續(xù)狀態(tài)。癲癇發(fā)作達到Ⅳ～Ⅴ級并持續(xù)達30 min者為造模成功。發(fā)作持續(xù)1 h后腹腔注射地西泮(10 mg/kg)以終止發(fā)作。空白組給予腹腔注射等容量生理鹽水。

1.3.3 給藥方式：造模成功后第1天，給予空白組、模型組及神經(jīng)節(jié)苷脂鈉組大鼠經(jīng)腹腔注射水合氯醛(400 mg/kg)麻醉，將大鼠固定于ZS-B型大鼠立體定位儀，切開頭皮，暴露顱骨,以右側(cè)海馬CA3 中心區(qū)為注射靶點，用微量注射器給予神經(jīng)節(jié)苷脂鈉組大鼠注射神經(jīng)節(jié)苷脂鈉注射液20 μL，每隔10 d注射1次，連續(xù)注射3次；空白組、模型組于同時間注入等容量無菌生理鹽水，完成注射后留針5 min，退針后縫合頭皮。陽性對照組給予丙戊酸鈉(400 mg/kg)腹腔注射，3次/d，連續(xù)30 d。

1.4 觀察指標

1.4.1 Morris水迷宮實驗：(1)定位航行實驗。采用WMT-100型水迷宮進行實驗。于給藥第40天開始對各組大鼠進行訓(xùn)練及測試。將大鼠面朝池壁，隨機從不同的4個象限入水點入水1次，每天訓(xùn)練4次，共訓(xùn)練5 d。記錄90 s內(nèi)大鼠自入水至爬上平臺所需時間，即逃避潛伏期。若入水后90 s內(nèi)未找到平臺，或未爬上平臺，則將大鼠放置于平臺站立10 s后休息30～60 s，再進行下一次訓(xùn)練。記錄各組大鼠逃避潛伏期和游泳總距離。(2)空間探索實驗。于水迷宮實驗第6天進行空間探索實驗，檢測各組大鼠對原平臺的記憶能力。撤除平臺后，將大鼠從平臺對側(cè)象限的中點放入水中，記錄大鼠在90 s內(nèi)穿越平臺的次數(shù)、游泳總距離及在原平臺象限的探索時間。

1.4.2 血清IL-1β、IL6、TNF-α含量檢測：給藥第45天，水迷宮實驗結(jié)束后，給予大鼠腹腔注射水合氯醛(400 mg/kg)麻醉，解剖大鼠后經(jīng)腹主動脈采血2 mL，3 000 r/min離心15 min取血清，分裝置于-20℃保存待測。嚴格按照ELISA試劑盒說明書操作，檢測大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α的水平。方法為從-20℃冰箱取出血清，常溫下放置1 h后，3 000 r/min離心15 min后取上清液檢測。樣品孔加入待檢樣品10 μL，依次加入樣品稀釋劑40 μL，相應(yīng)抗體100 μL，置于37℃孵育1 h，用試劑盒配套洗滌液洗滌5次。每孔加入底物液A、B各50 μL顯色，37℃避光孵育15 min。各反應(yīng)孔加入終止液50 μL，于酶標儀450 nm下檢測各孔吸光度值。

1.4.3 Nissl染色觀察海馬結(jié)構(gòu)的形態(tài)學(xué)變化：實驗結(jié)束后，腹腔注射水合氯醛(400 mg/kg)麻醉大鼠并采集血標本后，采用隨機數(shù)字表法分別于各組隨機選取7只大鼠，開胸暴露心臟，用生理鹽水(4℃)沖洗血液，再灌注含4%多聚甲醛的磷酸緩沖鹽溶液，灌注1 h后立即剝離腦組織，置于4%多聚甲醛溶液中4℃固定72 h，將腦組織經(jīng)冠狀面均勻切成3段，取中間含海馬段腦組織行石蠟包埋，做5 μm厚連續(xù)冠狀切片，取石蠟切片進行Nissl染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)改變。

1.4.4 海馬組織中TLR-4、NF-κB p65、MyD88蛋白表達水平的檢測：實驗結(jié)束后，取各組其余8只大鼠，同法麻醉后剝離腦組織獲取大鼠海馬組織，采用免疫印跡試驗法檢測大鼠海馬組織中TLR-4、NF-κB p65、MyD88的蛋白表達水平。取大鼠海馬組織100～200 mg，提取總蛋白，二喹啉甲酸法測定蛋白濃度，制作十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠，上樣后行電泳，電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)印至硝酸纖維膜，采用含5%脫脂牛奶的封閉液室溫封閉硝酸纖維膜2 h，一抗(1 ∶1 000)4℃孵育過夜，TBST洗膜；二抗(1 ∶5 000)37℃孵育1 h，TBST洗膜，于暗室用發(fā)光液孵育膜后，在凝膠成像系統(tǒng)中曝光，采用Image J 軟件分析各條帶灰度值，以β-肌動蛋白為內(nèi)參，計算目的蛋白與內(nèi)參蛋白灰度值的比值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以(x±s)表示，多組樣本間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用t檢驗。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 神經(jīng)節(jié)苷脂鈉對癲癇大鼠定位航行能力的影響 水迷宮實驗期間，與空白組大鼠相比，其他3組大鼠第1～5天的逃避潛伏期均延長；與模型組相比，陽性對照組及神經(jīng)節(jié)苷脂鈉組大鼠逃避潛伏期時間均縮短(均P<0.05)，但兩組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。與空白組相比，其他3組大鼠實驗游泳總距離均增加；與模型組相比，陽性對照組、神經(jīng)節(jié)苷脂鈉組大鼠游泳總距離縮短(均P<0.05)，但兩組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表1 各組大鼠逃避潛伏期的比較(x±s，s)

表2 各組大鼠游泳總距離的比較(x±s，cm)

2.2 神經(jīng)節(jié)苷脂鈉對癲癇大鼠空間探索能力的影響 水迷宮實驗期間，與空白組大鼠相比，其他3組大鼠在原平臺象限探索有效時間比率及游泳距離比率降低，穿越原平臺次數(shù)減少(均P<0.05)。與模型組比較，陽性對照組及神經(jīng)節(jié)苷脂鈉組大鼠在原平臺象限探索有效時間及游泳距離比率升高，穿越原平臺次數(shù)增多(均P<0.05)，但兩組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 各組大鼠原平臺象限探索有效時間比率、游泳距離比率、穿越平臺次數(shù)的比較(x±s)

2.3 神經(jīng)節(jié)苷脂鈉對癲癇大鼠血清IL-1β、TNF-α、IL-6含量的影響 與空白組大鼠比較，其他3組大鼠血清IL-1β、TNF-α、IL-6的含量升高(均P<0.05)；與模型組相比，陽性對照組、神經(jīng)節(jié)苷脂鈉組IL-1β、TNF-α、IL-6含量降低(均P<0.05)；與陽性對照組相比，神經(jīng)節(jié)苷脂鈉組血清TNF-α含量降低(P<0.05)，但兩組IL-1β、IL-6差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表4 各組大鼠血清中IL-1β、TNF-α、IL-6的含量比較(x±s，ng/mL)

2.4 神經(jīng)節(jié)苷脂鈉對大鼠海馬組織神經(jīng)元形態(tài)的影響 Nissl染色可見，空白組大鼠海馬CA3 區(qū)神經(jīng)細胞密度高，排列整齊，尼氏體染色均勻，尼氏小體豐富。模型組大鼠海馬CA3 區(qū)可見神經(jīng)元損傷，細胞核固縮，細胞間隙擴張，結(jié)構(gòu)紊亂，尼氏體出現(xiàn)凝集，數(shù)量減少。陽性對照組、神經(jīng)節(jié)苷脂鈉組大鼠的海馬CA3 區(qū)異常神經(jīng)元數(shù)量減少，細胞排列比較規(guī)律，尼氏體數(shù)量較模型組有所增加，神經(jīng)細胞變性程度較模型組減輕。見圖1。

圖1 各組大鼠海馬組織神經(jīng)元形態(tài)(Nissl染色，×400)

2.5 神經(jīng)節(jié)苷脂鈉對大鼠海馬組織TLR-4、NF-κB p65、MyD88蛋白表達水平的影響 與空白組相比，其他3組大鼠海馬組織TLR-4、NF-κB p65、MyD88蛋白相對表達水平升高(均P<0.05)；與模型組比較，陽性對照組及神經(jīng)節(jié)苷脂鈉組大鼠海馬組織TLR-4、NF-κB p65、MyD88蛋白表達水平均降低(均P<0.05)，但兩組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖2和表5。

圖2 各組TLR-4、NF-κB p65、MyD88蛋白表達情況

表5 各組大鼠海馬組織中TLR-4-MyD88通路相關(guān)蛋白相對表達水平的比較(x±s)

3 討 論

癲癇是一種常見的慢性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，是由多種原因引起的腦內(nèi)神經(jīng)元反復(fù)異常放電，以反復(fù)不自主發(fā)作為主要臨床特點[1]。經(jīng)抗癲癇藥物治療后，目前有70%～80%的癲癇患者癲癇發(fā)作得到有效控制，但仍有20%～30%的患者治療效果不理想[4]，且臨床常規(guī)的抗癲癇藥物也存在頭暈、嗜睡、行為改變等多種不良反應(yīng)。因此，尋找療效較好且毒副作用小的抗癲癇藥物具有重要的臨床意義。

神經(jīng)節(jié)苷脂是一類從豬腦中提取的具有神經(jīng)保護作用的生物制劑，常用于腦出血、腦梗死、脊髓損傷及顱腦損傷性疾病的治療[12]。單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂鈉，即神經(jīng)節(jié)苷脂鈉，是哺乳動物腦組織中神經(jīng)節(jié)苷脂的主要種類。其能夠穿透血腦屏障，修復(fù)各種原因引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷，因而成為藥理學(xué)及臨床研究的熱點[5]。臨床研究表明，神經(jīng)節(jié)苷脂鈉注射液能夠有效減輕癲癇患者的癥狀，并能減少常規(guī)抗癲癇藥物引起的并發(fā)癥，在癲癇的治療上具有良好的應(yīng)用價值。例如，李小戰(zhàn)[13]的臨床研究顯示，在常規(guī)抗癲癇藥物的基礎(chǔ)上應(yīng)用神經(jīng)節(jié)苷脂鈉注射液能夠更有效控制癲癇發(fā)作，改善患者臨床癥狀，對腦外傷癲癇患者療效良好。此外，有研究顯示，神經(jīng)節(jié)苷脂鈉還能夠有效減少癲癇患者常規(guī)抗癲癇治療相關(guān)不良反應(yīng)的發(fā)生[14]。以上研究結(jié)果提示，神經(jīng)節(jié)苷脂鈉在癲癇的治療中具有較大的潛力。但目前關(guān)于神經(jīng)節(jié)苷脂鈉抗癲癇作用的機制如何，研究報告較少。

氯化鋰-毛果蕓香堿誘導(dǎo)的癲癇持續(xù)狀態(tài)大鼠模型主要表現(xiàn)為癲癇反復(fù)發(fā)作及海馬組織病理學(xué)改變，被認為是目前最理想的癲癇動物模型[10]。因此，本研究采用氯化鋰-毛果蕓香堿誘導(dǎo)癲癇持續(xù)狀態(tài)大鼠模型，探討神經(jīng)節(jié)苷脂鈉側(cè)腦室注射對癲癇大鼠認知功能和神經(jīng)炎癥的作用及其機制。癲癇持續(xù)狀態(tài)反復(fù)發(fā)生可引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷，繼而導(dǎo)致不同程度的認知功能障礙，主要包括記憶力減退、學(xué)習能力及智力水平下降等改變[15]。現(xiàn)普遍認為位于大腦丘腦和內(nèi)側(cè)顳葉之間的海馬在人的記憶功能中起著重要作用，在認知障礙者中常可見到該區(qū)域的病理變化[16]。海馬皮質(zhì)可劃分為CA1、CA2、CA3、CA4四個部分，其中CAl和CA3與學(xué)習、記憶以及認知功能相關(guān)。研究表明，癲癇持續(xù)狀態(tài)可引起海馬CAl及CA3區(qū)神經(jīng)元損傷，并引起海馬組織病理性改變[17]。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠水迷宮實驗的逃避潛伏期延長，游泳距離增加，在原平臺象限探索有效時間比率及游泳距離比率降低，穿越原平臺次數(shù)減少，表明模型組大鼠出現(xiàn)學(xué)習記憶能力下降及隨意運動障礙。癲癇模型病理改變?yōu)楹ｑR神經(jīng)元的丟失，海馬區(qū)可見存活神經(jīng)元和尼氏體含量的減少，通過Nissl染色可觀察神經(jīng)元的受損程度，本研究的Nissl染色顯示，模型組大鼠海馬CA3 區(qū)可見神經(jīng)元損傷，細胞核固縮，細胞間隙擴張，結(jié)構(gòu)紊亂，尼氏體出現(xiàn)凝集，數(shù)量減少，提示模型建立成功。經(jīng)側(cè)腦室注射神經(jīng)節(jié)苷脂鈉后，與模型組比較，大鼠在水迷宮實驗過程中逃避潛伏期及游泳距離縮短，找到平臺時間縮短，穿越原平臺次數(shù)增加，且神經(jīng)元損傷情況減輕，提示神經(jīng)節(jié)苷脂鈉能夠減輕氯化鋰-毛果蕓香堿所致的癲癇持續(xù)狀態(tài)大鼠的認知功能障礙和神經(jīng)元損傷。

盡管癲癇所致認知障礙的機制還不十分明確，但許多學(xué)者認為神經(jīng)炎癥反應(yīng)與其發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。癲癇發(fā)作后能夠促使局部炎性因子分泌，進而迅速引起腦組織炎癥反應(yīng)，這種現(xiàn)象稱為“神經(jīng)炎癥”[18]。研究表明，神經(jīng)炎癥反應(yīng)能夠引起神經(jīng)元損傷，促使海馬區(qū)域炎癥反應(yīng)放大并分泌大量炎性因子，從而導(dǎo)致認知功能障礙[19]。有研究顯示，在癲癇動物模型及癲癇患者腦組織中，IL-1β、 IL-6及TNF-α等促炎性細胞因子表達水平均升高，提示癲癇發(fā)病可能與炎癥反應(yīng)有關(guān)[20]。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠血清IL-1β、TNF-α、IL-6的含量升高，提示癲癇大鼠體內(nèi)存在炎癥反應(yīng)；而與模型組相比，陽性對照組、神經(jīng)節(jié)苷脂鈉組IL-1β、TNF-α、IL-6含量降低(均P<0.05)，提示神經(jīng)節(jié)苷脂鈉能夠減輕神經(jīng)炎癥，從而改善大鼠的認知功能障礙。

TLR-4-MyD88信號通路與癲癇的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。TLR-4主要表達于腦組織的星形膠質(zhì)細胞、小膠質(zhì)細胞及神經(jīng)元，可以與脂多糖、IL-1等炎癥因子結(jié)合，進一步激活下游信號分子[21]。Maroso等[22]研究發(fā)現(xiàn)，癲癇小鼠海馬組織中TLR-4的表達增多，經(jīng)TLR-4特異性拮抗劑處理后，小鼠癲癇癥狀明顯減輕。NF-κB p65位于TLR通路的下游，與TNF-α、IL-6等多種促炎細胞因子的表達密切相關(guān)，是炎癥過程中炎癥介質(zhì)的重要調(diào)節(jié)因子[23]。MyD88是TLR-4介導(dǎo)信號通路的關(guān)鍵蛋白，能夠促使 NF-κB p65由胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到胞核，從而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用；其還可以上調(diào) IL-1β、TNF-α等炎癥因子的表達，導(dǎo)致炎性級聯(lián)反應(yīng)，從而加快癲癇的進展[24]。本研究結(jié)果顯示，與空白組相比，模型組大鼠海馬組織TLR-4、NF-κB p65、MyD88蛋白表達水平升高；與模型組比較，陽性對照組及神經(jīng)節(jié)苷脂鈉組大鼠海馬組織TLR4、NF-κB p65、MyD88蛋白表達水平均降低(均P<0.05)。這提示神經(jīng)節(jié)苷脂鈉能夠有效降低大鼠海馬組織中TLR-4、NF-κB p65、MyD88的蛋白表達以減輕神經(jīng)炎癥，從而發(fā)揮保護神經(jīng)功能的作用。

綜上所述，神經(jīng)節(jié)苷脂鈉能夠減輕氯化鋰-毛果蕓香堿誘導(dǎo)的癲癇持續(xù)狀態(tài)大鼠的神經(jīng)炎癥，并改善大鼠認知功能障礙，其作用機制可能與抑制TLR4-MyD88信號通路的激活有關(guān)。