西安市大田土壤中抗藥性煙曲霉發(fā)生率調(diào)查

崔 寧,王 培,許寧俠

(西安外事學(xué)院，陜西 西安 710077)

煙曲霉(Aspergillusfumigatus)是一種普遍分布在全球各地額腐生真菌，可作為分解者參與自然環(huán)境中的養(yǎng)分循環(huán)[1]。煙曲霉是曲霉屬中重要的條件致病菌之一，對(duì)于免疫防御系統(tǒng)出現(xiàn)功能性障礙的病人，煙曲霉可沉積在肺泡等部位，從而引起過(guò)敏性、慢性或急性侵襲性曲霉病，僅侵襲性曲霉病患者的死亡率就高達(dá)40%～90%[2]。

自上世紀(jì)90年代以來(lái)，三唑類藥物是預(yù)防和治療人和動(dòng)物曲霉病的主要藥物如伏立康唑、伊曲康唑和泊沙康唑等，它們的使用使患者的生存率得到了顯著的提升[3]。1997年，Denning等[4]首次報(bào)道了煙曲霉對(duì)三唑類藥物產(chǎn)生了抗藥性，他們從加利福尼亞一位長(zhǎng)期接受伊曲康唑治療的患者痰液中分離到了抗伊曲康唑煙曲霉菌株，自此有關(guān)煙曲霉抗藥性被頻繁報(bào)道。歐洲、美國(guó)、印度、中東、非洲和中國(guó)等地均已檢測(cè)出抗性煙曲霉，煙曲霉對(duì)三唑類醫(yī)藥的抗藥性現(xiàn)已成為全球的公共衛(wèi)生問(wèn)題[5]。

除了在接受或未接受過(guò)臨床治療的患者樣品中分離出抗性煙曲霉，世界各地的環(huán)境樣品中也頻繁分離出抗性煙曲霉。近些年來(lái)，有研究報(bào)道指出病人體內(nèi)的煙曲霉抗性菌可能來(lái)源于環(huán)境中三唑類農(nóng)藥的使用，而不是服用三唑類藥物后在體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生。醫(yī)用三唑類與農(nóng)用三唑類化合物化學(xué)結(jié)構(gòu)相似且作用機(jī)制相同，均為甾醇抑制劑，可作用于 14α-脫甲基酶，通過(guò)阻止麥角甾醇的生物合成達(dá)到殺菌的作用。因此本研究采集西安市周邊大田土壤樣品，分析土壤樣品中抗藥性煙曲霉的發(fā)生率及其相關(guān)機(jī)制，為曲霉病的預(yù)防與治療提供相關(guān)的實(shí)際環(huán)境監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器

伯能CT90A全自動(dòng)蒸汽滅菌器；知楚ZQZY-88CV全溫震蕩培養(yǎng)箱；Gilson移液槍PL系列(1 μL、10 μL、100 μL、1 mL)；美菱DW-HL678超低溫冰箱-86°C；WEALTEC GES核酸水平電泳槽；WEALTEC公司KETACX化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)；美國(guó)伯騰Epoch超微量核酸蛋白定量?jī)x；Beckman Microfuge20R微型冷凍離心機(jī)；Esco單人水平流超凈工作臺(tái)。

1.2 試劑

泊沙康唑(POC)(>99.9%)，購(gòu)自美國(guó) Sigma-Aldrich 公司；伏立康唑(VRC)(>99.9%)，購(gòu)自德國(guó) Dr.Ehrenstorfer GmbH 公司；伊曲康唑(ITZ)(>98.0%)，購(gòu)自德國(guó) Dr.Ehrenstorfer GmbH 公司；氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品(>98.0%)和柱式基因組DNA抽提試劑盒均購(gòu)自于生工生物工程(上海)股份有限公司；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，購(gòu)自上海博微生物科技有限公司；RPMI-1640 培養(yǎng)基，購(gòu)自美國(guó) Sigma-Aldrich 有限公司；沙氏固體培養(yǎng)基，購(gòu)自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司。

1.3 土壤樣品采集

2020年9月在西安市周邊大田采集0～5 cm的表層土壤樣品，用無(wú)菌塑料袋密封冰袋冷藏保存運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，于4°C保存。

1.4 煙曲霉的分離和鑒定

取約3 g土壤樣品于30 mL無(wú)菌生理鹽水中，置于搖床震蕩培養(yǎng)2 h，搖床條件設(shè)置為37℃、150 rpm。2 h取出后在無(wú)菌條件下吸取40 μL土壤懸濁液，涂布在含有100 mg·L-1氯霉素的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上，將其放置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d。

挑取疑似煙曲霉分離物參照它們的顏色、形態(tài)等宏觀特征，孢子分化等微觀特點(diǎn)，以及是否能在48℃條件下生長(zhǎng)等耐熱性綜合判定，并采用柱式基因組DNA抽提試劑盒提取疑似煙曲霉DNA，隨后以基因組DNA為模板擴(kuò)增菌株ITS基因片段，引物選擇真菌ITS通用引物ITS1和ITS4。擴(kuò)增序列委托通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司進(jìn)行純化與測(cè)序。測(cè)序得到的序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)序列比對(duì)，實(shí)現(xiàn)對(duì)菌株的鑒定。

1.5 煙曲霉藥物敏感性測(cè)定

采用美國(guó)國(guó)家臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(CLSI，2008)推薦的M38-A2方案—微量肉湯稀釋法測(cè)定ITZ、VRC和POS對(duì)煙曲霉的最低抑菌濃度(Minimum inhibitory concentration, MIC)。MIC值是培養(yǎng)48 h后真菌生長(zhǎng)完全受到抑制的最低濃度。煙曲霉對(duì)伊曲康唑、泊沙康唑和伏立康唑的敏感性判斷標(biāo)準(zhǔn)詳見(jiàn)表1。

表1 煙曲霉對(duì)藥物的敏感性水平 (MIC: mg·L-1)

1.6 煙曲霉cyp51A基因擴(kuò)增及分析

按照1.4的方法進(jìn)行煙曲霉DNA的提取。采用Ren等(2017)[6]提到的引物A7(TCATATGTTGCTCAGCGG)和P450-A2(CTGTCTCACTTGGATGTG)擴(kuò)增cyp51A基因及其啟動(dòng)子序列。通過(guò)與GenBank序列號(hào)為AF338659的野生型煙曲霉cyp51A基因序列比較，確定菌株cyp51A基因是否存在氨基酸位點(diǎn)替換。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤中煙曲霉的分離率

本項(xiàng)目共收集西安市周邊大田土壤樣品36份，其中15份土壤樣品中共分離出34株煙曲霉菌株，21份土壤樣品中未分離出煙曲霉菌株，土壤樣品中煙曲霉菌株的分離率為41.7%(表2)，這與現(xiàn)有煙曲霉調(diào)查報(bào)道的數(shù)據(jù)一致。Cao等(2020)[7]對(duì)2014、2016和2018年三年杭州市部分醫(yī)院綠化帶周圍采集到的59、68和64份土壤樣品進(jìn)行煙曲霉的分離和敏感性測(cè)定，結(jié)果表明這三年樣品中分別分離到43、105和134株煙曲霉，分離率分別為45.8%、64.7%和62.5%。Ren等(2017)[6]采集了144份溫室大棚土壤樣品，其中58份樣品可篩分離出煙曲霉菌株，分離率為40.3%。本實(shí)驗(yàn)中，土壤樣品中煙曲霉的分離率為41.7%，結(jié)果表明煙曲霉廣泛存在于西安農(nóng)田土壤中。

表2 土壤樣品在煙曲霉的分離率

2.2 土壤樣品中煙曲霉抗藥性

2020年9月西安市周邊大田土壤樣品中所分離出的煙曲霉抗性菌株對(duì)三種醫(yī)用三唑類藥物的MIC值詳見(jiàn)表3。由表可知，本次分離出的34株煙曲霉菌株中共有2株(R-5和R-17)表現(xiàn)出三唑類藥物的抗藥性，抗性菌株占煙曲霉菌株總數(shù)的5.9%。其中菌株R-5具有對(duì)伏立康唑和伊曲康唑的交叉抗性，MIC值分別為8 mg·L-1和4 mg·L-1，但未表現(xiàn)出泊沙康唑的抗藥性；菌株R-17具有伊曲康唑的高抗性，MIC值>16 mg·L-1，同時(shí)也對(duì)伏立康唑表現(xiàn)出抗藥性，MIC值為4 mg·L-1，對(duì)泊沙康唑未表現(xiàn)出明顯的抗藥性。相較于泊沙康唑，環(huán)境中的煙曲霉更容易產(chǎn)生對(duì)伊曲康唑和伏立康唑的抗藥性。Wang 等(2018)[8]在臺(tái)灣2 760份空氣和土壤樣品中分離出451株煙曲霉，其中34株菌株至少對(duì)一種三唑類藥物表現(xiàn)出抗藥性，抗性菌株的分離率為7.54%。Cao等(2020)[7]在2014、2016和2018年杭州部分醫(yī)院土壤樣品中分離出的抗藥性煙曲霉數(shù)分別為2、10和14株，對(duì)應(yīng)的抗性菌株分離率分別為4.65%、9.52%和10.4%，抗性菌株分離率逐年上升。實(shí)驗(yàn)從土壤中分離出的抗性菌株占煙曲霉菌株總數(shù)的5.9%，表明西安周邊大田土壤樣品中存在抗藥性煙曲霉，而這些抗性菌株對(duì)于臨床治療曲霉病將會(huì)帶來(lái)更大的挑戰(zhàn)。

表3 抗性煙曲霉對(duì)三唑類藥物的敏感性

2.3 抗性菌株cyp51A基因分析

在目前煙曲霉已報(bào)道的或可能存在的抗性機(jī)制中，cyp51A突變導(dǎo)致的三唑類藥物抗性是最常見(jiàn)也是最主要的機(jī)制。為了闡明這些菌株的抗性機(jī)制，通過(guò)cyp51A基因的擴(kuò)增、測(cè)序和比對(duì)，結(jié)果表明R-5抗性菌株無(wú)基因突變，菌株中可能存在其他抗性機(jī)制。Cui 等(2019)[9]用戊唑醇誘導(dǎo)用潮霉素基因標(biāo)記的敏感煙曲霉菌株，其中HI-30和HI-36菌株分別誘導(dǎo)出了ITZ(MIC>16 mg·L-1)和VRC(MIC>16 mg·L-1)高抗藥性，但cyp51A未檢測(cè)出突變，熒光定量PCR結(jié)果顯示兩株菌株外排泵基因過(guò)量表達(dá)，抗性機(jī)制可能與此有關(guān)。

R-17菌株cyp51A基因存在TR34/L98H/S297T/F495I 型突變。cyp51A基因中唑類結(jié)合位點(diǎn)氨基酸的多態(tài)性會(huì)直接影響藥物與酶的結(jié)合親和力，進(jìn)而使菌株獲得抗藥性。Mellado等(2004)[10]首次證明了煙曲霉cyp51A基因的突變與其抗藥性相關(guān)，接著cyp51A基因各種抗性相關(guān)突變也被不斷報(bào)道。Jensen 等人(2016)[11]從丹麥臨床上分離出 1 098 株煙曲霉，其中 64 株具有抗藥性且cyp51A基因帶有 P216L、M220K、G54W 等突變；van der Linden 等人(2015)[12]在荷蘭分離純化出的 60 株菌株中有 47 株具有唑類抗性，并發(fā)現(xiàn)了 M220I、M220K/E317G、P381R/D481E、L77V/L399I/D481E、M220I/L319V、G54R、M220R、G54E、G54W、Q249H、L329V 等突變的存在；除上述已證實(shí)的與煙曲霉耐藥性相關(guān)的熱點(diǎn)cyp51A基因突變外，不斷有新的突變類型被報(bào)道。其中，TR34/L98H被認(rèn)為是最常見(jiàn)也是最主要的抗性突變之一[13]。

3 結(jié)論

目前不少研究指出農(nóng)用和醫(yī)用三唑類藥物均可導(dǎo)致煙曲霉產(chǎn)生交叉抗藥性。部分臨床研究表明抗藥性煙曲霉來(lái)源于土壤等自然環(huán)境，因此煙曲霉在環(huán)境中獲得唑類抗性已成為一個(gè)值得重視的公眾衛(wèi)生問(wèn)題。本研究調(diào)查了西安36份土壤樣品，從中篩選到了2株抗藥性煙曲霉，抗性煙曲霉的發(fā)生率為5.9%。其中R-17菌株cyp51A基因具有TR34/L98H/S297T/F495I 型突變。本項(xiàng)目的數(shù)據(jù)為曲霉病的防治提供相關(guān)理論依據(jù)。