西安市大田土壤中抗藥性煙曲霉發生率調查

崔 寧,王 培,許寧俠

(西安外事學院，陜西 西安 710077)

煙曲霉(Aspergillusfumigatus)是一種普遍分布在全球各地額腐生真菌，可作為分解者參與自然環境中的養分循環[1]。煙曲霉是曲霉屬中重要的條件致病菌之一，對于免疫防御系統出現功能性障礙的病人，煙曲霉可沉積在肺泡等部位，從而引起過敏性、慢性或急性侵襲性曲霉病，僅侵襲性曲霉病患者的死亡率就高達40%～90%[2]。

自上世紀90年代以來，三唑類藥物是預防和治療人和動物曲霉病的主要藥物如伏立康唑、伊曲康唑和泊沙康唑等，它們的使用使患者的生存率得到了顯著的提升[3]。1997年，Denning等[4]首次報道了煙曲霉對三唑類藥物產生了抗藥性，他們從加利福尼亞一位長期接受伊曲康唑治療的患者痰液中分離到了抗伊曲康唑煙曲霉菌株，自此有關煙曲霉抗藥性被頻繁報道。歐洲、美國、印度、中東、非洲和中國等地均已檢測出抗性煙曲霉，煙曲霉對三唑類醫藥的抗藥性現已成為全球的公共衛生問題[5]。

除了在接受或未接受過臨床治療的患者樣品中分離出抗性煙曲霉，世界各地的環境樣品中也頻繁分離出抗性煙曲霉。近些年來，有研究報道指出病人體內的煙曲霉抗性菌可能來源于環境中三唑類農藥的使用，而不是服用三唑類藥物后在體內誘導產生。醫用三唑類與農用三唑類化合物化學結構相似且作用機制相同，均為甾醇抑制劑，可作用于 14α-脫甲基酶，通過阻止麥角甾醇的生物合成達到殺菌的作用。因此本研究采集西安市周邊大田土壤樣品，分析土壤樣品中抗藥性煙曲霉的發生率及其相關機制，為曲霉病的預防與治療提供相關的實際環境監測數據。

1 材料與方法

1.1 儀器

伯能CT90A全自動蒸汽滅菌器；知楚ZQZY-88CV全溫震蕩培養箱；Gilson移液槍PL系列(1 μL、10 μL、100 μL、1 mL)；美菱DW-HL678超低溫冰箱-86°C；WEALTEC GES核酸水平電泳槽；WEALTEC公司KETACX化學發光凝膠成像系統；美國伯騰Epoch超微量核酸蛋白定量儀；Beckman Microfuge20R微型冷凍離心機；Esco單人水平流超凈工作臺。

1.2 試劑

泊沙康唑(POC)(>99.9%)，購自美國 Sigma-Aldrich 公司；伏立康唑(VRC)(>99.9%)，購自德國 Dr.Ehrenstorfer GmbH 公司；伊曲康唑(ITZ)(>98.0%)，購自德國 Dr.Ehrenstorfer GmbH 公司；氯霉素標準品(>98.0%)和柱式基因組DNA抽提試劑盒均購自于生工生物工程(上海)股份有限公司；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基，購自上海博微生物科技有限公司；RPMI-1640 培養基，購自美國 Sigma-Aldrich 有限公司；沙氏固體培養基，購自青島高科技工業園海博生物技術有限公司。

1.3 土壤樣品采集

2020年9月在西安市周邊大田采集0～5 cm的表層土壤樣品，用無菌塑料袋密封冰袋冷藏保存運回實驗室，于4°C保存。

1.4 煙曲霉的分離和鑒定

取約3 g土壤樣品于30 mL無菌生理鹽水中，置于搖床震蕩培養2 h，搖床條件設置為37℃、150 rpm。2 h取出后在無菌條件下吸取40 μL土壤懸濁液，涂布在含有100 mg·L-1氯霉素的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基平板上，將其放置于37℃培養箱中培養5 d。

挑取疑似煙曲霉分離物參照它們的顏色、形態等宏觀特征，孢子分化等微觀特點，以及是否能在48℃條件下生長等耐熱性綜合判定，并采用柱式基因組DNA抽提試劑盒提取疑似煙曲霉DNA，隨后以基因組DNA為模板擴增菌株ITS基因片段，引物選擇真菌ITS通用引物ITS1和ITS4。擴增序列委托通用生物系統(安徽)有限公司進行純化與測序。測序得到的序列與NCBI數據庫序列比對，實現對菌株的鑒定。

1.5 煙曲霉藥物敏感性測定

采用美國國家臨床實驗室標準協會(CLSI，2008)推薦的M38-A2方案—微量肉湯稀釋法測定ITZ、VRC和POS對煙曲霉的最低抑菌濃度(Minimum inhibitory concentration, MIC)。MIC值是培養48 h后真菌生長完全受到抑制的最低濃度。煙曲霉對伊曲康唑、泊沙康唑和伏立康唑的敏感性判斷標準詳見表1。

表1 煙曲霉對藥物的敏感性水平 (MIC: mg·L-1)

1.6 煙曲霉cyp51A基因擴增及分析

按照1.4的方法進行煙曲霉DNA的提取。采用Ren等(2017)[6]提到的引物A7(TCATATGTTGCTCAGCGG)和P450-A2(CTGTCTCACTTGGATGTG)擴增cyp51A基因及其啟動子序列。通過與GenBank序列號為AF338659的野生型煙曲霉cyp51A基因序列比較，確定菌株cyp51A基因是否存在氨基酸位點替換。

2 結果與分析

2.1 土壤中煙曲霉的分離率

本項目共收集西安市周邊大田土壤樣品36份，其中15份土壤樣品中共分離出34株煙曲霉菌株，21份土壤樣品中未分離出煙曲霉菌株，土壤樣品中煙曲霉菌株的分離率為41.7%(表2)，這與現有煙曲霉調查報道的數據一致。Cao等(2020)[7]對2014、2016和2018年三年杭州市部分醫院綠化帶周圍采集到的59、68和64份土壤樣品進行煙曲霉的分離和敏感性測定，結果表明這三年樣品中分別分離到43、105和134株煙曲霉，分離率分別為45.8%、64.7%和62.5%。Ren等(2017)[6]采集了144份溫室大棚土壤樣品，其中58份樣品可篩分離出煙曲霉菌株，分離率為40.3%。本實驗中，土壤樣品中煙曲霉的分離率為41.7%，結果表明煙曲霉廣泛存在于西安農田土壤中。

表2 土壤樣品在煙曲霉的分離率

2.2 土壤樣品中煙曲霉抗藥性

2020年9月西安市周邊大田土壤樣品中所分離出的煙曲霉抗性菌株對三種醫用三唑類藥物的MIC值詳見表3。由表可知，本次分離出的34株煙曲霉菌株中共有2株(R-5和R-17)表現出三唑類藥物的抗藥性，抗性菌株占煙曲霉菌株總數的5.9%。其中菌株R-5具有對伏立康唑和伊曲康唑的交叉抗性，MIC值分別為8 mg·L-1和4 mg·L-1，但未表現出泊沙康唑的抗藥性；菌株R-17具有伊曲康唑的高抗性，MIC值>16 mg·L-1，同時也對伏立康唑表現出抗藥性，MIC值為4 mg·L-1，對泊沙康唑未表現出明顯的抗藥性。相較于泊沙康唑，環境中的煙曲霉更容易產生對伊曲康唑和伏立康唑的抗藥性。Wang 等(2018)[8]在臺灣2 760份空氣和土壤樣品中分離出451株煙曲霉，其中34株菌株至少對一種三唑類藥物表現出抗藥性，抗性菌株的分離率為7.54%。Cao等(2020)[7]在2014、2016和2018年杭州部分醫院土壤樣品中分離出的抗藥性煙曲霉數分別為2、10和14株，對應的抗性菌株分離率分別為4.65%、9.52%和10.4%，抗性菌株分離率逐年上升。實驗從土壤中分離出的抗性菌株占煙曲霉菌株總數的5.9%，表明西安周邊大田土壤樣品中存在抗藥性煙曲霉，而這些抗性菌株對于臨床治療曲霉病將會帶來更大的挑戰。

表3 抗性煙曲霉對三唑類藥物的敏感性

2.3 抗性菌株cyp51A基因分析

在目前煙曲霉已報道的或可能存在的抗性機制中，cyp51A突變導致的三唑類藥物抗性是最常見也是最主要的機制。為了闡明這些菌株的抗性機制，通過cyp51A基因的擴增、測序和比對，結果表明R-5抗性菌株無基因突變，菌株中可能存在其他抗性機制。Cui 等(2019)[9]用戊唑醇誘導用潮霉素基因標記的敏感煙曲霉菌株，其中HI-30和HI-36菌株分別誘導出了ITZ(MIC>16 mg·L-1)和VRC(MIC>16 mg·L-1)高抗藥性，但cyp51A未檢測出突變，熒光定量PCR結果顯示兩株菌株外排泵基因過量表達，抗性機制可能與此有關。

R-17菌株cyp51A基因存在TR34/L98H/S297T/F495I 型突變。cyp51A基因中唑類結合位點氨基酸的多態性會直接影響藥物與酶的結合親和力，進而使菌株獲得抗藥性。Mellado等(2004)[10]首次證明了煙曲霉cyp51A基因的突變與其抗藥性相關，接著cyp51A基因各種抗性相關突變也被不斷報道。Jensen 等人(2016)[11]從丹麥臨床上分離出 1 098 株煙曲霉，其中 64 株具有抗藥性且cyp51A基因帶有 P216L、M220K、G54W 等突變；van der Linden 等人(2015)[12]在荷蘭分離純化出的 60 株菌株中有 47 株具有唑類抗性，并發現了 M220I、M220K/E317G、P381R/D481E、L77V/L399I/D481E、M220I/L319V、G54R、M220R、G54E、G54W、Q249H、L329V 等突變的存在；除上述已證實的與煙曲霉耐藥性相關的熱點cyp51A基因突變外，不斷有新的突變類型被報道。其中，TR34/L98H被認為是最常見也是最主要的抗性突變之一[13]。

3 結論

目前不少研究指出農用和醫用三唑類藥物均可導致煙曲霉產生交叉抗藥性。部分臨床研究表明抗藥性煙曲霉來源于土壤等自然環境，因此煙曲霉在環境中獲得唑類抗性已成為一個值得重視的公眾衛生問題。本研究調查了西安36份土壤樣品，從中篩選到了2株抗藥性煙曲霉，抗性煙曲霉的發生率為5.9%。其中R-17菌株cyp51A基因具有TR34/L98H/S297T/F495I 型突變。本項目的數據為曲霉病的防治提供相關理論依據。