2,4-二氯苯氧乙酸對幼齡SD大鼠肝毒性的研究

黃立利，張夢云，劉科亮，龐定國，劉麗達，徐培渝，

(1．四川大學華西公共衛生學院毒理與病理學系，四川 成都 610041；2．蘇州瑞博生物技術有限公司毒理部，北京 100085；3．四川省疾病預防與控制中心毒理所，四川 成都 610041)

2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-dichlorophenoxyacetic acid，2,4-D)是一種可以作為植物生長抑制劑的特殊激素，因其毒性相對適中而成為應用最廣泛的除草劑之一，被用于種植農業、牧場、森林管理、花園和水生植被的控制。人和動物接觸被這種除草劑污染的空氣、飲用水、土壤和食品可能會造成健康風險。體內研究發現，大鼠暴露于100 mg/(kg·d)2,4-D可能導致少突膠質細胞低髓鞘形成。72.5 mg/kg 2,4-D可干擾大鼠生殖器官的發育，產生生殖毒性。亞慢性低劑量2,4-D暴露改變了小鼠血漿酰基肉堿水平并誘導腸道微生物群紊亂，影響腸道微生物群的組成和功能。已有文獻證實，2,4-D可通過活性氧(reactive oxygen species，ROS)的產生引起腎臟氧化損傷，最終導致器官組織的退行性和壞死改變。肝臟是積聚農藥代謝物的主要部位，因此，作為維持葡萄糖和脂質穩態最重要的器官和相關酶產生的器官，肝臟可以成為2,4-D毒作用的靶點。目前2,4-D在動物和人體內的毒性機制尚不十分明確。已有的研究提示2,4-D在體內和體外均可能會產生肝細胞氧化應激。對魚肝細胞的體外研究發現，即使在低濃度下2,4-D也會破壞細胞能量代謝，使氧利用率下降導致維持細胞內環境穩態的ATP供應不足，增加氧化應激，從而造成肝損傷；在體內研究中也發現2,4-D可以抑制肝臟乳酸糖異生，同時降低細胞ATP水平，這與體外實驗相佐證，氧化損傷可能是2,4-D造成肝毒性的途徑之一。除了機體無法代償外界化學物對細胞的損傷而導致細胞壞死以外，細胞的死亡還可能是由程序化的凋亡過程啟動的。有學者進行體外研究發現2,4-D可能通過破壞線粒體跨膜電位導致細胞凋亡。本研究擬用幼齡SD大鼠通過28 d重復毒性試驗，從細胞凋亡、氧化應激途徑進一步探討2,4-D致肝毒性及其機制，為2,4-D所致肝毒性的作用機制及防治提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

SPF級剛斷乳21 d的SD大鼠64只，體質量60～80 g，由四川省中醫藥科學院實驗動物中心提供[合格證號SCXK(川)2008-19號]。適應性喂養3 d后進行試驗，整個實驗過程中，大鼠飼養于屏障級動物房[許可證號SYXK(川)2011-043號]。動物自由飲水和攝食，動物房溫度控制在20～24℃，相對濕度保持在55%～65%。

1.2 受試品及主要試劑

2,4-D原藥，純度98%，購自北京精華耀邦醫藥科技有限公司；丙二醛(malonaldehyde，MDA)、還原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)、總超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase，T-SOD)試劑盒以及大鼠細胞色素C酶聯免疫檢測試劑盒、Caspase-3、Caspase-9活性測試盒均購自南京建成生物工程研究所；小牛血清白蛋白購于Sigma公司，考馬斯亮藍G-250購自錦江區鑫鴻瑞實驗儀器經營部，其余試劑均為國產分析純，均購自成都博奧維新試劑有限公司。

1.3 動物分組和染毒方法

SD大鼠適應性飼養3 d后，隨機分為4組，每組16只，雌雄各半。大鼠2,4-D經口半數致死劑量(median lethal dose，LD)值為 375～666 mg/kg，無可見作用水平(no-observed-effect level，NOEL)為15 mg/(kg·d)。因此實驗設2,4-D低、中、高劑量染毒組(分別為18.125、36.250、72.500 mg/kg)和 1個陰性溶劑對照組，用1%的羧甲基纖維素作為樣品溶劑，大鼠按0.01 mL/g計算灌胃體積，每天一次經口灌胃，連續染毒28 d，染毒期間，每周稱量體質量2次，以此來調整給藥濃度。每日觀察所有幼鼠的一般行為，大小便及中毒癥狀，記錄體質量。實驗結束后，采取股動脈放血法將動物處死，同時取肝臟稱量質量，之后用天平稱取肝組織0.4 g，制作肝勻漿，離心后取上清液，用于肝臟組織中GSH、T-SOD和MDA的測定。同時取肝0.4 g并用生理鹽水清洗后，置于凍存管中，放入液氮罐中凍存，用于細胞色素C濃度、Caspase-3、Caspase-9相對活性的測定。

1.4 組織病理檢查

每只大鼠取肝臟約3 mm×4 mm，固定于40 mL(10%)的甲醛溶液中，依次經酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋之后切片，從動物肝左葉中部做橫切面取材，切5～8 μm厚片，之后作常規HE染色，鏡下觀察。

1.5 大鼠肝勻漿中GSH、T-SOD、MDA的測定

天平稱取肝組織0.4 g，放入手動玻璃勻漿器中，同時加冰生理鹽水3.6 mL，將其制成肝勻漿，最后將勻漿液轉入5 mL離心管中，3 500 r/min離心10 min，取上清液，轉入到5 mL的EP管中。采用二硫二硝基苯甲酸[dithio bis-(2-nitrobenzoic acid)，DTNB]直接法檢測GSH活性、黃嘌呤氧化酶法測定T-SOD活性、TBA法檢測MDA濃度，測定步驟均按照試劑盒說明進行。

1.6 大鼠肝組織中細胞色素C、Caspase-3、Caspase-9的測定

從液氮中取出凍存的肝組織，放入研缽中進行研磨。研磨時，不斷向研缽中加入液氮，直至將組織研磨成淡粉色細粉末狀。研磨完成后稱取0.1 g轉入到1.5 mL帶蓋離心管中，加入0.9 mL PBS緩沖液，之后4℃，12 000 r/min離心15 min，取上清液。采用分光光度計在450 nm處測定標準品與樣品吸光度值

D

(450)，得出標準曲線的直線回歸方程，之后在回歸方程上計算出與之對應的樣品中細胞色素C的濃度。在400 nm處測定樣品吸光度

D

(400)值來計算Caspase-3、Caspase-9相對活性，計算公式：

1.7 統計學方法

2 結果

2.1 一般情況

實驗期間各組大鼠除72.500 mg/kg 2,4-D染毒組以外，活動狀態良好，各組動物均未出現死亡。與對照組比較，18.125與36.250 mg/kg 2,4-D染毒組大鼠染毒后體質量增長無明顯差異，72.500 mg/kg組大鼠于染毒第14天起，體質量增長速度明顯較對照組減緩。至染毒結束，72.500 mg/kg 2,4-D染毒組大鼠體質量與對照組比較，差異有統計學意義(

P

＜0.05)，如圖1所示。

圖1 2,4-D染毒對大鼠體質量的影響

2.2 2,4-D染毒對幼齡SD大鼠肝臟濕質量及臟器系數的影響

與對照組比較，72.500 mg/kg 2,4-D染毒組大鼠肝臟濕質量降低明顯，且差異有統計學意義(

P

＜0.05)，如圖2A所示；但該組大鼠的肝臟系數與對照組比較差異無統計學意義，如圖2B所示。

2.3 幼齡SD大鼠肝臟組織的病理觀察

HE染色后觀察大鼠肝組織病理學改變見圖3。與對照組比較，18.125與36.250 mg/kg 2,4-D染毒組肝組織未觀察到明顯差異(圖3B、C)，72.500 mg/kg 2,4-D染毒組大鼠部分肝組織出現膽管增生，并伴有炎細胞的浸潤。

2.4 2,4-D染毒對幼齡SD大鼠GSH、T-SOD、MDA的影響

大鼠肝勻漿中GSH、T-SOD、MDA的檢測結果見圖4。與陰性對照組比較，72.500 mg/kg 2,4-D染毒組肝勻漿中GSH含量、T-SOD活性明顯降低，MDA含量顯著升高，差異有統計學意義(

P

＜0.05)；36.250 mg/kg 2,4-D染毒組的T-SOD活性，與對照比較，也下降明顯，差異有統計學意義(

P

＜0.05)。

2.5 2,4-D染毒對幼齡SD大鼠細胞色素C、Caspase-3、Caspase-9的影響

大鼠肝組織中細胞色素C、Caspase-3、Caspase-9的檢測結果見圖5。與對照組比較，36.250和72.500 mg/kg 2,4-D染毒組的肝組織中細胞色素C濃度升高明顯，差異有統計學意義(

P

＜0.05)。與對照組比較，36.250和72.500 mg/kg 2,4-D染毒組的肝組織中Caspase-3、Caspase-9相對活性均明顯增加，差異有統計學意義(

P

＜0.05)。

圖2 2,4-D染毒對大鼠肝臟濕質量及臟器系數的影響

圖3 2,4-D染毒28 d后幼齡SD大鼠肝組織切片HE染色觀察病理學改變

圖42,4-D染毒大鼠對GSH、T-SOD、MDA的影響

3 討論

本研究結果顯示，2,4-D可影響幼齡SD大鼠的生長，抑制其體質量的增加，因此，雖然高劑量染毒組大鼠的肝臟濕質量與對照組比較有所降低，且差異有統計學意義，但肝臟的臟器系數與對照組比較無明顯變化，此外病理組織學也顯示僅有部分肝組織發生膽管增生，并未表現出明顯的病理損傷，需進行更詳細的檢查來明確膽管增生的病理意義。

圖5 2,4-D染毒大鼠對細胞色素C、Caspase-3、Caspase-9的影響

細胞凋亡是指為了維持機體內環境的相對穩定，機體自發的進行基因調控，使不需要的細胞發生程序性死亡，涉及一系列基因的激活、表達以及調控等作用。目前認為肝細胞發生凋亡主要通過3條途徑：線粒體依賴性細胞凋亡、內質網應激介導的細胞凋亡和死亡受體通路途徑。Caspase-3、Caspase-9都是半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)家族的重要成員。Caspase-9是細胞凋亡過程中比較上游的一個蛋白酶，當線粒體跨膜電位在各種類型凋亡誘導因素的作用下降低時，線粒體內、外膜之間的通透性轉換孔會由關閉轉換為開放，導致線粒體膜通透性增大，引起線粒體膜通透性轉換作用(mitochondrial permeability transition，MPT)，線粒體釋放細胞色素C到胞漿中，觸發Caspases級聯反應，Caspase-9與細胞色素C和Apaf1形成復合物，同時被激活，激活的Caspase-9可以進一步激活誘導細胞凋亡發生的關鍵酶Caspase-3，進而促進后續的細胞凋亡信號，最終導致細胞凋亡的發生。本次研究結果顯示，36.250 mg/kg的2,4-D即可引起Caspase-3、Caspase-9和細胞色素C釋放的增加，與對照組比較，差異有統計學意義(

P

＜0.05)，說明2,4-D可通過改變線粒體的通透性，釋放細胞色素C，激活Caspase-3、Caspase-9途徑，誘導肝細胞發生凋亡。

當細胞出現自由基代謝失衡時，則可導致細胞發生氧化損傷和細胞凋亡，同時氧化損傷又可加劇細胞凋亡的發生。近年來，越來越多的證據表明，ROS在許多慢性疾病、衰老和惡性腫瘤的發展進程中發揮著重要作用。農藥暴露可通過產生過量ROS，如超氧陰離子、過氧化氫、羥基自由基、過氧自由基和單線態氧等，導致氧化應激。ROS是細胞在正常過程中產生的，在正常情況下，細胞的抗氧化系統將ROS造成的損害最小化。當ROS的產生增加到一定程度，超過了細胞的抗氧化系統清除能力，就會導致氧化應激。氧化應激發生時，機體主要表現為ROS和抗氧化防御之間的平衡受到干擾，這一過程會導致細胞功能的改變，并會對細胞結構和組織造成嚴重損害。肝損傷產生的過量自由基可廣泛損傷肝細胞，導致肝細胞壞死、脂質大量積蓄進而引起脂質過氧化產物MDA含量顯著變化。GSH和SOD是體內重要的抗氧化劑和自由基清除劑，其可與化學毒物或其代謝產物相結合，減少MDA的生成，進而保護細胞的結構和功能。因此GSH和SOD的含量可反映機體抗氧化的能力，而MDA的含量則可反映機體氧化損傷的程度。本次研究結果顯示，36.250 mg/kg的2,4-D即可引起機體MDA的生成增加，同時降低SOD、GSH的活性，表明2,4-D可引起肝臟發生脂質過氧化反應，且隨著劑量的增加，作用程度加劇。

綜合以上實驗結果，我們推測，2,4-D可導致幼齡SD大鼠肝毒性的發生，其發生的途徑可能是通過氧化損傷和細胞凋亡，但更具體的相關毒作用機制、涉及的基因表達還需進一步研究。毒性通路是近年來的一個研究熱點，指常態化的細胞反應生化通路，在被外源化學物充分擾動后導致的有害健康效應，它涵蓋了本研究所提到的應激反應通路，對其進行深入研究更有助于實施外源化學物風險評估的預測策略，將實驗結果進行外推，保護和促進人類健康。