漆姑草醇提物對白血病細胞K562的誘導分化作用

伏 瓊，唐文娟，程 勇，賀仁政，梁 冰，2，

(1．貴州醫科大學藥理學教研室，貴州 貴陽550025；2．貴州醫科大學環境污染與疾病監控教育部重點實驗室，貴州 貴陽 550025)

白血病全世界每年新發病例約30萬，死亡率高達70%，在我國死亡率是3.86/10萬，其中兒童所占比率日益增加，嚴重威脅著人類健康。白血病是多因素、多基因，多分子機制參與的血液系統惡性腫瘤，其進展快，常規治療手段有聯合化療、基因治療、免疫治療等，預后差。誘導分化治療白血病不直接殺傷白血病細胞，而是誘導白血病細胞分化為正常細胞或接近正常細胞，逐漸成為白血病治療的主要治療策略之一。大量天然藥物及其成分對白血病細胞的誘導分化作用的研究，讓從中草藥中開發高效低毒的分化誘導劑成為白血病治療的熱點。漆姑草味苦，性涼，生于陰濕處，為石竹科植物漆姑草的全草，民間治療白血病效果明確。本實驗通過漆姑草醇提物(

Herba Saginae Japonicae

，HSJ)對慢性粒細胞性白血病細胞(K562)的作用，探討HSJ對白血病細胞誘導分化的機制，擬為漆姑草對白血病的治療作用闡明理論依據，結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑

TS-100-F倒置相差顯微鏡(日本Nikon公司)；Elx 800UV酶聯免疫檢測儀(美國Bio-Tek公司)；BD FACSCantoⅡ Flow Cytometer 338960流式細胞儀(美國Becton Dikson公司)；凝膠成像分析儀(美國Bio-Rad公司)。

漆姑草全草，購于貴陽市藥材市場，經貴州醫科大學龍慶德教授鑒定；臺盼藍、四甲基噻唑藍(thiazolyl blue tetrazolium bromide，MTT)、1640 培養基及雙抗(美國Hyclone公司)；胎牛血清(杭州四季青生物工程有限公司)；二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO，美國Merck公司)；硝基四氮唑藍(nitrotetrazolium bluechloride， NBT， 美 國 Sigma-Aldrich公司)；佛波酯(phorbol ester，TPA，浙江聯科生物有限公司)；瑞氏、吉姆薩粉劑(北京索萊寶科技有限公司)；異硫氰酸熒光素標記的粒細胞單克隆抗體(fluorescein isothiocyanate-CD14，FITC-CD14)、別藻藍蛋白標記的粒細胞單克隆抗體(allophycocyanin-CD11b，APC-CD11b)、藻紅蛋白標記的巨噬細胞單克隆抗體(p-phycoerythin-CD42，PE-CD42)和藻紅蛋白標記的巨核細胞單克隆抗體(p-phycoerythin-CD41a，PE-CD41a)均為美國BD公司產品；珠蛋白轉錄因子1(globin transcription factor 1，GATA-1)抗體、造血轉錄因子1(hematopoietic transcription factor，PU.1)抗體和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)兔抗人單克隆抗體為武漢三鷹生物技術有限公司產品；羊抗兔IgG-HRP(美國Santa Cruz公司)。

1.2 漆姑草醇提物制備

漆姑草全草50 g用70%乙醇，50℃水浴提取4 h，趁熱過濾，減壓濃縮，得HSJ干浸膏，制備20 mg/mL的母液，經0.22 μm微孔濾膜過濾，-20℃貯存備用。

1.3 分組與處理

K562細胞(源自中國科學院上海細胞庫)置于含有10%胎牛血清的1640培養基中，于37℃、CO體積分數為5%飽和濕度的恒溫培養箱中培養。于96孔板中按1×10個/mL接種對數生長期的K562細胞懸液，培養24 h后，設HSJ高、中、低濃度(分別為250、125、62.5 μg/mL)3個實驗組和陰性對照組(等體積1640培養基)，每組3個復孔，繼續培養48 h。

1.4 指標與方法

1.4.1 細胞增殖抑制率檢測

采用MTT法，收集細胞，每孔加入5 mg/mL的MTT 20 μL，培養箱孵育4 h后，3 000 r/min離心15 min，棄上清。每孔加入200 μL DMSO，振蕩溶解結晶，酶標儀測定吸光度

D

(490)值，取平均值計算藥物對細胞生長的抑制率。

1.4.2 NBT還原實驗

收集細胞，離心棄上清，沉淀加1 mg/mL的NBT 200 μL和100 μg/mL的佛波酯10 μL混勻，37℃避光溫育1 h，離心棄上清，每個樣本分別涂片3次，光學顯微鏡下隨機計數200個細胞，計數陽性細胞數(胞質內含有灰藍顆粒為陽性細胞)，取平均值計算NBT還原率。

1.4.3 細胞形態觀察

采用瑞氏-吉姆薩染色法，收集細胞懸液，PBS洗滌1次，離心棄上清，沉淀加100 μL PBS重懸后涂片，加甲醇固定10 min，雙蒸水沖洗3 min，晾干，加瑞氏-吉姆薩染色工作液(瑞氏-吉姆薩染色原液∶PBS=1∶9，

V/V

)染色30 min，自來水沖洗3 min，晾干，倒置顯微鏡觀察細胞形態并拍照。

1.4.4 分化相關抗原 CD11b、CD14、CD41a、CD42b表達陽性細胞檢測

采用流式細胞術，收集細胞，用預冷PBS洗2次，將細胞分至A、B兩只流式管，A管加APC-CD11b單克隆抗體3 μL、FITCCD14單克隆抗體5 μL、PE-CD41a單克隆抗體5 μL混勻；B管加PE-CD42b單克隆抗體5 μL混勻，室溫避光靜置孵育15 min，PBS洗滌1次，重新加PBS到流式管刻度線處，吹打均勻，通過流式細胞儀檢測CD11b、CD14、CD41a和CD42b的熒光強度，分析分化相關抗原CD11b、CD14、CD41a和CD42b陽性細胞的表達率。

1.4.5 K562細胞GATA-1和PU.1蛋白表達檢測

采用Western blot法，收集細胞，用預冷PBS洗滌1次，加裂解液(細胞裂解液∶蛋白酶抑制劑=99∶1，

V

/

V

)，冰上裂解15 min，4℃、12 000 r/min離心10 min，吸取上清液，二喹啉甲酸(BCA)法蛋白定量后制樣，煮沸5 min。以12%的聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離，濕電轉移法轉移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜，室溫下封閉1.5 h后加入適當濃度的一抗(GATA-1單抗1∶1 000稀釋，PU.1單抗1∶500稀釋，內參照GAPDH單抗為1∶5 000稀釋)，4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，每次5 min，加二抗稀釋液(1∶10 000)，室溫孵育2 h，TBST洗膜3次，每次5 min，化學發光法顯色，暗室曝光、顯影、定影，掃描灰度值進行統計分析。

1.5 統計學分析

2 結果

2.1 漆姑草對K562細胞增殖的影響

經不同濃度HSJ作用48 h后，K562細胞增殖能力受到不同程度抑制(

P

＜0.05)，隨著濃度的增加K562細胞增殖抑制率增加，見表1。

表1 HSJ對K562細胞增殖抑制率和NBT還原能力的影響(±s，n=3)

2.2 漆姑草對K562細胞NBT還原能力的影響

與對照組相比，250、125、62.5 μg/mL HSJ組K562細胞的NBT還原率均升高，差異均有統計學意義(

P

＜0.05)，見表1。

2.3 漆姑草對K562細胞形態的影響

陰性對照組細胞的胞核呈圓形，結構完整，核漿比例較大；經不同濃度HSJ處理后，細胞核漿比例減小，出現分葉狀細胞核，兩葉、三葉或者多葉，部分細胞核凹陷出現明顯的細胞分化狀態，隨著給藥濃度的增加細胞核縮小程度越大，分化細胞越多，見圖1。

圖1 漆姑草對K562細胞形態的影響

2.4 漆姑草對K562細胞分化相關抗原CD11b、CD14、CD41a、CD42b表達的影響

與陰性對照組比較，經不同濃度HSJ作用后，K562細胞分化相關抗原CD11b、CD14、CD41a和CD42b陽性表達率均不同程度升高，差異均具有統計學意義(

P

＜0.05)，見表2和圖2。

表2 HSJ對分化相關抗原CD11b、CD14、CD41a、CD42b陽性表達率的影響(±s，%)

2.5 漆姑草對K562細胞GATA-1和PU.1蛋白表達的影響

與陰性對照組比較，經不同濃度HSJ作用48 h后，GATA-1和PU.1蛋白表達水平均增加，差異均有統計學意義(

P

＜0.05)，見圖3、表3。

圖2 漆姑草對K562細胞分化相關抗原CD11b、CD14、CD41a、CD42b表達的影響

圖3 HSJ對K562細胞GATA-1和PU.1蛋白表達的影響

表3 HSJ對K562細胞GATA-1和PU.1蛋白表達水平的影響

3 討論

白血病是造血系統惡性克隆性疾病，骨髓造血干細胞失去分化成熟的能力而停滯在幼稚階段，大量原始與早期幼稚血細胞急劇增生直接釋放到血液中，被稱為“液體腫瘤”，浸潤其他臟器組織，正常的造血功能被抑制，其治療可采用放療、化療和骨髓移植等。K562細胞為慢性粒細胞白血病細胞，在K562細胞向紅系、粒系、巨核系細胞方向分化時，K562細胞的形態、功能、分化相關抗原和蛋白表達均會發生一系列變化。中藥具有高效低毒、資源豐富、標本兼治的特點，且具有治療效果溫和、不良反應小等優點，故從其中尋找誘導分化劑已成為白血病誘導分化治療的熱點之一。漆姑草民間用于白血病的治療，療效確切，但其治療白血病的機制研究較少，本文以K562細胞為實驗對象，探討漆姑草醇提取物對K562細胞的分化誘導作用，并分析其誘導分化的作用機制。

白血病細胞持續分裂和不斷增殖是癌細胞的一個重要特征，細胞的分化成熟度與細胞增殖能力呈負相關，即細胞分化越成熟，其生長能力越弱，因此藥物對腫瘤細胞的增殖抑制能力，是其分化的一個重要標志。本研究結果顯示，不同濃度HSJ對K562細胞增殖能力具有抑制作用；K562細胞經250、125、62.5 μg/mL HSJ作用48 h后，細胞向成熟方向改變并出現明顯的分化形態；在佛波酯的激發下，成熟度較高的細胞內超氧陰離子產生增多，可將水溶性淡黃色的活性染料NBT還原為不溶性藍黑色顆粒-甲臜。NBT還原實驗顯示，與陰性對照組相比，NBT陽性細胞明顯增多，K562細胞功能趨近成熟。采用瑞氏-吉姆薩染色法，細胞包漿呈藍色，細胞核呈藍紫色，從形態學的角度直觀觀察，給藥組K562細胞核直徑變小，出現明顯的分葉現象，兩葉、三葉或者多葉，核漿比例減少，核仁減少或消失，核染色質濃縮，胞漿豐富，出現明顯的分化形態。白血病細胞與正常造血干、祖細胞一樣，在分化成熟過程中細胞表面的抗原標志不斷發生變化，在獲得一些新抗原的同時也丟失了某些原有的抗原。因此，不同的分化抗原可作為細胞分化各個階段的表面標志，根據分化抗原表達可較精確判斷細胞所處的分化階段。成熟粒系細胞分化的標志CD11b、單核細胞標志抗原CD14、巨噬細胞表面分化抗原CD41a、巨核細胞分化抗原CD42b，流式細胞術檢測分化相關抗原陽性表達率可以反映細胞的分化方向及階段。本研究結果顯示，與陰性對照組相比，不同濃度HSJ作用K562細胞48 h后，CD14、CD11b、CD41a和CD42b陽性表達率均增加(

P

＜0.05)。GATA結構是其他紅系非珠蛋白基因的啟動子或增強子活化所必需的，被稱為紅系特異轉錄因子的

GATA-1

基因主要調控紅系和巨核系的發育，而在粒系、單核系的成熟過程中則受抑制；PU.1是從原癌基因

SpI-1

的產物中分離出的一種新的蛋白因子，不在紅系和T細胞表達，但促進白血病細胞向髓系方向發育。在本次實驗中我們發現GATA-1蛋白、PU.1蛋白表達增加，提示HSJ能誘導K562細胞向成熟粒細胞、單核細胞、巨核細胞和紅細胞方向分化。

本研究從細胞的形態、功能、分化相關抗原及蛋白表達等方面證實HSJ能誘導K562細胞向成熟細胞方向分化，結合臨床成熟分化誘導劑，存在不同程度的毒副作用，且單用復發率相當高，臨床耐藥病例日漸增多的現狀，開發高效低毒的天然分化誘導劑治療白血病，成為研究熱點，漆姑草作為民間治療白血病的天然藥物，其誘導分化能力被進一步證實，但誘導分化的機制還不是很明確，為了更好的開發利用漆姑草資源，其分化誘導的機制有待進一步深入研究。