漆姑草醇提物對人急性早幼粒白血病細胞的誘導(dǎo)分化作用

唐文娟，伏 瓊，程 勇，羅世成，梁 冰，2，

（1．貴州醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室，貴州 貴陽550025；2．貴州醫(yī)科大學(xué)環(huán)境污染與疾病監(jiān)控教育部重點實驗室，貴州 貴陽 550025)

白血病是一種血液惡性腫瘤，其發(fā)病特點在于不成熟的細胞喪失分化能力和大量的幼稚細胞積累。近年來，誘導(dǎo)細胞分化是白血病聯(lián)合化療的主要策略之一。1986年全反式維甲酸在白血病中 的應(yīng)用，開啟了腫瘤細胞誘導(dǎo)分化治療的新方法。但目前常用的分化誘導(dǎo)劑存在較嚴重的副反應(yīng)，使其臨床應(yīng)用受到限制，因此從我國傳統(tǒng)中草藥中尋找新的分化誘導(dǎo)劑是探索白血病治療的途徑之一。

漆姑草(

Herba Saginae Japonicae

，HSJ)是石竹科植物漆姑的全草，具有解毒止癢、散結(jié)消腫之功效，民間常用于治療癰腫、漆瘡、齲齒痛、淋巴結(jié)結(jié)核、白血病等病癥。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，HSJ對慢性髓系白血病細胞和早幼粒白血病細胞增殖具有抑制作用，并能誘導(dǎo)慢性髓系白血病細胞和早幼粒白血病細胞向成熟細胞方向分化。本次研究對象為人急性早幼粒白血病細胞(NB4)，通過研究HSJ對NB4細胞的誘導(dǎo)分化作用，以期為HSJ在未來白血病的臨床治療中提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

漆姑草全草購自貴陽市藥材市場，經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)龍慶德教授鑒定；蛋白濃度測定試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；c-fos兔抗單克隆抗體(英國Abcam公司)；GAPDH兔抗人單克隆抗體(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)；羊抗兔 IgG-HRP(美國 Santa Cruz公司)；RNA提取試劑盒(大連寶生生物技術(shù)有限公司)。

1.2 HSJ醇提物制備

HSJ加入70%乙醇，50℃水浴提取4 h，抽濾，濾液濃縮得干浸膏，浸膏過濾除菌后，將母液(相當于生藥濃度224.8 mg/mL)置于冰箱中貯存。

1.3 分組與處理

NB4細胞于全培養(yǎng)基、37℃的CO培養(yǎng)箱中，將快速生長期的NB4細胞，接種培養(yǎng)24 h，在前期MTT實驗基礎(chǔ)上按低(30 μg/mL)、中(60 μg/mL)、高(120 μg/mL)劑量給予不同濃度HSJ醇提物，對照組給予等體積的全培養(yǎng)基(

V

∶

V

∶

V

=89∶10∶1)，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.4 指標與方法

1.4.1 電鏡觀察細胞形態(tài)

藥物作用48 h后，收集細胞懸液，用PBS洗滌，500 r/min離心5 min，沉淀加戊二醛固定，置透射電鏡下觀察細胞核及染色質(zhì)等形態(tài)的變化。

1.4.2 NBT還原實驗

將佛波酯(12-O-tetradecanoylphorbol，TPA)和NBT加入到處理好的細胞中，于37℃水浴1 h，沉淀重懸涂片。陽性細胞在光鏡下胞漿內(nèi)含藍灰色顆粒，將細胞置于光鏡下觀察，計算NBT的還原率。

1.4.3 流式細胞術(shù)檢測細胞周期

冷乙醇固定NB4細胞，放入4℃冰箱中保存，用PBS洗滌，1 000 r/min離心10 min，沉淀中加RNase A重懸，于37℃水浴30 min，再加入PI進行染色，置4℃冰箱中孵育30min。通過流式細胞儀檢測波長488 nm處的紅色熒光。

1.4.4 細胞表面分化抗原CD11b和CD14陽性表達檢測

將APC-CD11b和FITC-CD14單克隆抗體加入到細胞中，避光孵育15 min后，用PBS洗滌，沉淀重懸，流式細胞儀上機檢測CD11b和CD14陽性細胞表達，計算陽性表達率。

1.4.5 基因mRNA表達檢測

采用實時熒光定量PCR(quantitative real time-PCR，qPCR)方法，先按RNA試劑盒提取總RNA，再用SYBR Green法合成cDNA，兩步法進行PCR擴增：預(yù)變性95℃、30 s，循環(huán)1次；退火95℃、5 s，延伸60℃、30 s，循環(huán)40次。以GAPDH為內(nèi)參，根據(jù)2法定量分析目的基因的表達。c-fos上游引物序列5′-GTCGGTCTTCC AGTCTCCAG-3′，下游序列 5′-TGATTTCCTTGATCG GGTTC-3′；GAPDH上游引物序列5′-GGAGCGAGAT CCCTCCAAAAT-3′，下游引物序列 5′-GGCTGTTGTC ATACTTCTCATGG-3′。

1.4.6 c-fos蛋白表達檢測

采用二喹啉甲酸法蛋白定量，將待測蛋白進行SDS-PAGE電泳，分離后的蛋白轉(zhuǎn)移及封閉，實驗按照蛋白濃度測定試劑盒(BCA)和SDS-PAGE凝膠制備試劑盒說明書操作，然后分別加入c-fos兔抗單克隆抗體(1∶1 000稀釋)，GAPDH兔抗單克隆抗體(1∶5 000稀釋)，4℃冰箱孵育。次日加入羊抗兔IgG-HRP二抗(1∶8 000稀釋)孵育，曝光。用凝膠成像系統(tǒng)分析目的蛋白條帶的光密度值。

1.5 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果

2.1 HSJ對NB4細胞形態(tài)的影響

電鏡下對照組NB4細胞形狀為圓形或橢圓形，細胞核核仁的輪廓清晰易見，且可觀察到雙核仁，胞核比例較大(圖1A)，而經(jīng)HSJ處理后，可見胞漿呈空泡狀，核仁消失或者減小，細胞核比例縮小，且胞核形狀呈腎形或蠶豆形，NB4細胞形態(tài)向成熟細胞階段分化(圖1B～D)。

圖1 透射電鏡觀察HSJ對NB4細胞形態(tài)的影響(×2 000)

2.2 HSJ對NB4細胞NBT還原能力的影響

經(jīng)HSJ作用后，NB4細胞NBT還原反應(yīng)中沉積不溶性藍黑色顆粒的NB4細胞數(shù)目增多，NBT還原率高于對照組，且隨HSJ濃度增加而增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

＜0.05，圖2)。

2.3 HSJ對NB4細胞周期的影響

經(jīng)HSJ作用后，3個HSJ劑量組的NB4細胞中G2期細胞均高于對照組，而S期細胞均低于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

＜0.05，圖3)。

圖2 HSJ對NB4細胞NBT還原能力的影響

圖3 HSJ對NB4細胞周期的影響

2.4 HSJ對分化相關(guān)抗原CD11b和CD14陽性細胞表達率的影響

經(jīng)HSJ作用后，3個HSJ劑量組的NB4細胞表面分化相關(guān)抗原CD11b和CD14陽性表達率均高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

＜0.05，圖4和圖5)。

圖4 HSJ對NB4細胞表面分化抗原CD14陽性表達率的影響

圖5 HSJ對NB4細胞表面分化抗原CD11b陽性表達率的影響

2.5 HSJ對NB4細胞c-fos mRNA和蛋白表達的影響

經(jīng)HSJ作用后，HSJ低劑量組c-fos mRNA和蛋白表達與對照組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(

P

＞0.05)，HSJ中劑量和高劑量組c-fos mRNA和蛋白表達均高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

＜0.05，圖6和圖7)。

圖6 HSJ對NB4細胞c-fos mRNA表達的影響

3 討論

急性白血病時大量幼稚細胞積累和喪失分化能力，主要表現(xiàn)為阻礙細胞分化，細胞成熟障礙，促進細胞分化現(xiàn)已成為臨床治療白血病可參考的主要策略之一。誘導(dǎo)細胞分化這一手段的特點在于不直接殺死腫瘤細胞，通過誘導(dǎo)劑的作用，誘導(dǎo)細胞向正常方向轉(zhuǎn)化，從而使腫瘤細胞的生物化學(xué)、形態(tài)及功能等方面接近正常細胞，是目前白血病臨床治療較為理想的手段之一。NB4細胞具有向成熟單核-巨噬系、粒系細胞方向分化的能力，是研究腫瘤細胞誘導(dǎo)分化的理想模型。在前期MTT實驗基礎(chǔ)上，本次研究以HSJ不同劑量作用于NB4細胞48 h，并進行后續(xù)實驗研究。

圖7 HSJ對NB4細胞c-fos蛋白表達的影響

形態(tài)分化是細胞分化最基本的特征表型，能直觀地反映藥物對細胞的誘導(dǎo)分化作用。本次實驗從形態(tài)學(xué)角度觀察NB4細胞經(jīng)過不同濃度的HSJ作用后，細胞形態(tài)發(fā)生的變化。電鏡下HSJ組細胞胞漿呈空泡狀，核仁減小或者消失，胞核比例縮小，且胞核形狀呈腎形或蠶豆形，NB4細胞形態(tài)向成熟細胞階段分化。然而在腫瘤細胞誘導(dǎo)分化研究中，形態(tài)改變不一定典型，單憑形態(tài)學(xué)判斷細胞是否分化有一定的爭議?，F(xiàn)已知，細胞功能的成熟是白血病細胞分化早期的標志之一，細胞功能越完善則分化成熟度越高。NBT是一種可溶性的淡黃色染料，通過TPA的激發(fā)，使細胞內(nèi)成熟度較高的超氧陰離子增多，淡黃色的NBT將被還原成不可溶的藍黑色沉淀-甲臜。NBT還原實驗結(jié)果顯示，HSJ低、中、高劑量組的NBT陽性表達均高于對照組，由此可知在HSJ誘導(dǎo)下NB4細胞具有向成熟細胞分化的能力。同時，細胞向成熟方向分化過程中的必要條件是細胞增殖抑制和細胞周期停滯，在細胞分化早期可以見到細胞增殖抑制和細胞周期變化，并且隨著細胞分化向后期推進等變化更加明顯。本次實驗表明細胞周期可被HSJ阻滯，細胞停滯在G2期，細胞DNA的合成和有絲分裂減少，細胞增殖能力受到抑制，促進了細胞分化。當腫瘤細胞發(fā)生進一步分化時細胞表面分化抗原也會隨之改變，本實驗為了進一步探討細胞分化方向和所處階段，通過流式細胞術(shù)檢測NB4細胞表面分化抗原CD11b和CD14的表達率。CD14是成熟單核-巨噬細胞的標志抗原，其表達升高可作為細胞分化成熟的標志之一；而CD11b是成熟粒系細胞的標志抗原，在成熟粒細胞中高表達。本研究結(jié)果表明，HSJ低、中、高劑量組NB4細胞CD14和CD11b陽性表達均高于對照組，提示HSJ能誘導(dǎo)細胞向成熟方向分化。

c-fos

基因是一種與細胞增殖抑制、分化有關(guān)的調(diào)節(jié)因子，c-fos在未成熟的早幼粒細胞中表達較低，但在分化成熟的粒細胞及單核-巨噬細胞中c-fos表達增高，因此有研究認為c-fos是細胞分化成熟的標志之一。本實驗表明，HSJ中、高劑量組c-fos mRNA和蛋白表達均高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。綜上，本研究從基因水平和蛋白水平進一步證實了HSJ能誘導(dǎo)NB4細胞向成熟方向分化，其作用機制可能與HSJ調(diào)控NB4細胞

c-fos

基因表達有關(guān)。