年齡和性別對正常人外周血淋巴細胞核質橋自發率的影響

趙 驊，陸 雪，蔡恬靜，田 梅，劉青杰

(中國疾病預防控制中心輻射防護與核安全醫學所，輻射防護與核應急中國疾病預防控制中心重點實驗室，北京 100088)

人外周血胞質分裂阻滯(cytokinesis-block，CB)分析由Fenech等于1985年提出，可通過分析雙核細胞中的微核(micronucleus，MN)、核質橋(nucleoplasmic bridge，NPB)及核芽(nuclear bud，NBD)檢測染色體損傷，已逐漸應用于遺傳毒性檢測和職業人群的健康監測等領域。

核質橋是雙核細胞兩個主核間的橋狀核質，是DNA錯誤修復、染色體重排和端粒融合的標志物。核質橋具有良好的劑量-效應關系，并有可能實現自動化分析，具有成為新的輻射生物劑量計的潛能。過往研究發現不同國家健康人群間核質橋自發率差異較大，且年齡和性別因素對其影響尚不明確。本研究選取了我國健康人群，采用胞質分裂阻滯法，分析了核質橋的自發率及年齡、性別對其的影響，為核質橋的影響因素研究提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 研究對象

供血者為98位健康成人，無重大急慢性疾病史、無化學毒物接觸史，采樣前6個月內未受到過電離輻射，其中男性52例，女性46例，年齡范圍為20～68歲，平均年齡為(40.7±12.6)歲。按年齡分為20～29歲組(22人)、30～39歲組(23人)、40～49歲組(25人)和50歲以上組(28人)。簽署知情同意書后，抽取每名受試者外周血2 mL，注入肝素抗凝管。本研究通過中國疾病預防控制中心輻射防護與核安全醫學所倫理委員會審查。

1.2 胞質分裂阻滯分析

將400 μL外周血加入到含有20%胎牛血清及0.2%植物凝血素(phytohemag-glutinin，PHA)的RPMI 1640培養基(2 mL)中，置于37℃溫箱培養40 h后，加入終濃度為10 μg/mL的細胞松弛素B(cytochalasin-B，Cyt-B)，混勻后繼續避光培養至68 h收獲細胞。采用胞質分裂阻滯法進行低滲(0.075 mol/L KCI)、固定兩次(

V

∶

V

=3∶1)、滴片、染色(Giemsa染液)。每名受試者外周血樣本設2個平行樣。

1.3 計數標準

光學顯微鏡放大400倍或1 000倍下，每個受試者觀察1 000個雙核細胞，計算核質橋、微核及核芽的發生率。計數標準參照Fenech等報道，其中雙核細胞應具有兩個獨立且核膜完整的細胞核、兩主核大小接近、與相鄰細胞不可重疊；核質橋位于雙核細胞中兩個主核之間，寬度小于主核直徑的1/4；微核是圓形或橢圓形且核膜完整的小核，直徑為主核直徑的1/16～1/3；核芽是與主核由核質連接的小核，連接寬度小于核芽直徑。

1.4 統計學處理

用SPSS 26.0軟件進行統計學處理，不同組間核質橋率、微核率、核芽率的比較采用Mann-Whitney

U

檢驗，年齡、性別與核質橋、微核、核芽的相關性采用Spearman相關檢驗，年齡與微核的關系采用線性回歸分析，以

P

＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 正常人群的核質橋自發率

本研究選取了98例正常個體，每位受試者分析1 000個雙核細胞，其中54例(55.1%)未觀察到核質橋，33例(33.7%)觀察到1個核質橋，11例(11.2%)觀察到2個核質橋。核質橋總體的自發率為(0.56±0.69)‰。男性核質橋自發率為(0.65±0.74)‰，女性核質橋自發率為(0.46±0.62)‰，核質橋自發率男性略高于女性，但差異并無統計學意義(

U

=1.32，

P

＞0.05，表1)。

表1 不同性別間核質橋、微核及核芽的自發率(±s)

男性和女性受試者不同年齡組的核質橋自發率見表2。結果表明，男性受試者在不同年齡組間，核質橋自發率差異無統計學意義(

U

＜1.49，

P

＞0.05)。女性受試者40～49歲組核質橋自發率最高，顯著高于20～29歲組(

U

=2.31，

P

＜0.05)。相同年齡組的男性和女性核質橋自發率差異均無統計學意義(

U

＜1.41，

P

＞0.05)。

2.2 正常人群的微核及核芽自發率

98例樣本中均觀察到了微核，其中最少的觀察到1個，最多的觀察到52個，微核總體自發率為(13.10±10.65)‰。男性微核自發率為(11.57±8.10)‰，女性微核自發率為(14.82±12.82)‰，微核自發率女性高于男性，且差異具有統計學意義(

U

=4.40，

P

＜0.05，表1)。男性和女性受試者不同年齡組的微核自發率見表2。男性和女性受試者在20～29歲組至40～49歲組微核自發率呈上升趨勢，男性50歲以上組稍有降低(

P

＞0.05)，女性50歲以上組顯著低于40～49組(

U

＞2.23，

P

＜0.05)。男性20～29歲組微核率高于女性(

U

=4.25，

P

＜0.05)，而40～49歲組和50歲以上組微核率低于女性，差異具有統計學意義(

U

＞4.84，

P

＜0.05)。98例樣本中，有26例(26.5%)未觀察到核芽，其余樣本中觀察到1～9個核芽，核芽總體自發率為(2.02±2.08)‰。男性、女性核芽自發率分別為(2.19±2.09)‰和(1.82±2.08)‰，差異無統計學意義(

U

=1.28，

P

＞0.05，表1)。男性和女性受試者不同年齡組的核芽自發率見表2。男性受試者在不同年齡組間，核芽自發率差異無統計學意義(

U

＜1.76，

P

＞0.05)。女性受試者40～49歲組核芽自發率最高，為3.36‰，顯著高于其余3組(

U

＞2.40，

P

＜0.05)。男性20～29歲組核芽自發率高于女性(

U

=3.57，

P

＜0.05)，其余3個年齡組，男性和女性核芽自發率差異均無統計學意義(

U

＜1.80，

P

＞0.05)。

表2 不同年齡組核質橋、微核及核芽的自發率(±s)

2.3 年齡、性別與核質橋、微核及核芽自發率的相關性

為探索年齡、性別與核質橋、微核、核芽自發率的相關性，對其進行了Spearman相關檢驗。結果表明，核質橋、核芽自發率與年齡、性別無明顯的相關性，微核自發率與年齡、核質橋及核芽自發率具有一定的正相關性(表3)。進一步對年齡與微核自發率進行了線性回歸分析，發現微核自發率具有隨年齡增加而上升的趨勢，在20～68歲間，年齡每增加1歲，微核自發率上升約為0.31‰。

表3 年齡、性別與核質橋、微核及核芽自發率的相關系數

3 討論

理想的生物劑量計，在具有良好劑量-效應關系和較強輻射敏感性的同時，還應在正常人群中具有較低的自發率，不受性別和年齡的影響，或與其具有明確的變化規律。染色體畸變分析是目前輻射生物劑量估算的金標準，主要分析指標是雙著絲粒染色體，已在國內外多次應用。研究表明，核質橋源于雙著絲粒染色體，因此，核質橋也有可能成為新的輻射生物劑量計。在相同的培養條件下，核質橋與雙著絲粒的發生率具有正相關性。雙著絲粒染色體的本底自發率很低，而受到電離輻射后則會出現較高的發生率。因此，探索核質橋的自發率及其在不同性別、年齡人群中的變化規律，對其成為輻射生物劑量計具有重要意義。

本研究發現核質橋在正常人群的自發率很低(0.56‰)，與雙著絲粒染色體接近(0.58‰)，遠低于微核自發率(13.10‰)和核芽自發率(2.02‰)。本研究核質橋自發率與Coskun等對土耳其人群(0.61‰)及Zijno等對意大利人群(0.61‰)的研究結果相近；高于Lope等對西班牙人群的報道，低于Cho等對韓國人群、Donmez-Altuntas等對土耳其人群、Nefic等對波黑人群及Garaj-Vrhovac等對克羅地亞人群的研究結果。不同報道中核質橋自發率差異較大，可能是由于不同種族之間的差異，也可能是年齡、性別不同或核質橋的判定標準不同所致。因此，應明確不同人群的核質橋自發率，確定核質橋在人群中的正常值區間，降低遺傳因素導致的本底水平的不穩定性，從而有效應對個體輻射暴露的篩查和生物劑量的評估。

過往研究表明，年齡、性別是影響核質橋自發率的重要因素，但在對不同國家健康人群的報道中結果不盡相同。本研究中，男性總體核質橋自發率略高于女性，但差異并無統計學意義(

P

＞0.05)；相同年齡組男性與女性的核質橋自發率差異也無統計學意義(

P

＞0.05)，與過往報道結果一致。但也有研究表明，男性核質橋自發率顯著高于女性，或者顯著低于女性。本研究中相關性檢驗結果表明，核質橋與年齡并無明顯相關關系。按不同年齡分組后，男性和女性核質橋自發率在20～29歲組至40～49歲組隨年齡的增加而增加，而50歲及以上組反而降低。可能與總體樣本量較少有關，下一步還將擴大樣本量，進一步證實本研究結果。有研究結果表明，年齡與核質橋自發率具有相關性。因此，性別、年齡因素對核質橋自發率的影響尚需更多的研究。此外，還有研究報道了吸煙、不良生活方式也可影響核質橋的自發率，因此今后的研究還將關注這些因素。本研究還分析了微核及核芽的自發率。微核總體自發率為13.10‰，屬于健康人群正常的自發率水平，但高于部分報道的健康人群微核率的自發率，可能是與本研究受試者的平均年齡較大(40.7歲)有關。微核自發率女性高于男性，核芽自發率在男性和女性之間差異無統計學意義(

P

＞0.05)。微核在男性和女性的不同年齡組中，差異均有統計學意義(

P

＜0.05)，而核芽僅在女性的不同年齡組中差異具有統計學意義(

P

＜0.05)。微核自發率存在性別差異在過往研究中已有報道，Mateuca等研究表明，微核自發率在健康人群中隨年齡增長有所升高，女性微核自發率高于男性，可能與X染色體形成的微核或X染色體缺失有關。年齡增長可導致DNA修復效率下降以及基因突變增多，從而引起DNA損傷增加，進而導致染色體損傷的頻率升高[24]。

綜上所述，本研究采用胞質分裂阻滯法，發現我國健康人群中的核質橋自發率較低，不受性別因素影響，在20～49歲范圍內具有隨年齡增加而升高的趨勢，為核質橋的影響因素研究提供了科學依據。