新藥心臟毒性體外檢測方法的建立

于志強，張華允，馬中春

(寧波海關技術中心/寧波中盛產品檢測有限公司，浙江 寧波 315100)

近年來，隨著科學技術不斷發展，新藥的研發項目也隨之迅速增多。新藥對心臟的毒副作用是其在開發過程中被淘汰的重要原因之一。因此，新藥的心臟毒性檢測在新藥的研發過程中尤為重要。

新藥心臟毒性是指新藥在相對較小的劑量和相對短的時間內對心臟生理功能產生影響或者對心肌細胞造成損傷的藥效反應。能夠引起心臟毒性的藥物主要包括直接抑制或者損傷心肌細胞的藥物，例如蒽環類的阿霉素、柔紅霉素等；引起液體潴留的藥物，例如噻唑烷二酮類等；烷化劑，例如環磷酰胺等；抗心力失常和鈣通道阻滯劑等藥物。藥物對心肌細胞的毒性機制復雜，并能夠引起心肌發生不可逆的損傷。但目前針對新藥安全評價的檢測方法主要是動物實驗，不能明確人用藥后的毒性癥狀和毒性劑量，同時不符合“3R”原則。因此尋找能夠準確，快速，敏感反映出外源性化合物對心肌造成損傷的檢測方法是近年來科研人員的研究重點。

本研究擬針對新藥中化合物對心臟造成的毒性作用建立一項應用人源心肌細胞的體外檢測方法，以期為新藥研發提供一種準確、便捷的檢測手段。為新藥的開發、臨床前實驗和質量檢測過程提供有效手段和技術支持。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人源心肌細胞(hPSC-CMs)，購自寧波醫諾生物科技有限公司。他莫昔芬和氟哌利多均購自Sigma公司。美國食品及藥物管理局(U.S.Food and Drug Administration，FDA)的 Comprehensive

in vitro

Proarrhythmia Assay(CiPA)項目將他莫昔芬歸類為低風險類別，將氟哌利多歸類為中風險類別；DMEM/F12培養基、胎牛血清均購自Gibco公司；胰蛋白酶購自Hy-Clone公司。

1.2 實驗儀器

96孔板購自Costar公司；CO培養箱購自德國Binder公司；倒置顯微鏡購自日本Olympus公司；超凈工作臺購自Biox公司；超速離心機購自德國Hermle公司；CardioExcyte96購自德國Nanion公司。

1.3 心肌毒性測定

將hPSC-CMs復蘇，傳代培養3 d后接種于提前用鋪板液包被好的電極矩陣96孔板中，hPSC-CMs培養基維持培養，由于存在邊緣效應和大概30%左右的損失率(包含接種后不跳或者基線不穩)，所以培養板在設計實驗的時候只選擇中間的孔。如果中間有部分不符合要求的孔可以從外圈選擇，這樣可以保證實驗的統一性。48 h后按每孔200 μL全部置換細胞培養液。

實驗分為加藥實驗組和不加藥對照組。加藥實驗組對于每個測試樣本，設置3個濃度梯度，每個濃度設置3個復孔，他莫昔芬濃度分別為0.33、1和3 μmol/mL，氟哌利多分別為0.11、0.33和1 μmol/mL。不加藥對照組給予等量的細胞培養液。加藥后1、2、3、6、9、12、18、24、30、36、42 和 48 h 采用CardioExcyte96設備檢測心肌細胞的場電位時程(field potential duration，FPD)和收縮頻率。場電位時程主要是指可興奮組織或細胞受到閾上刺激時，在靜息膜電位基礎上發生的快速、去極化引發的動作電位，其中動作電位從0相至3相結束的時程稱為動作電位時程。心臟收縮的頻率也稱之為安靜時心臟跳動的次數，簡稱為心率。心率與年齡有直接關系，年齡越小，由于新陳代謝比較快，交感神經的活性比較高，心臟收縮的頻率較快。

1.4 統計學方法

采用SPSS 17.0軟件進行數據處理，計算出各組數據的平均數和方差，在Excel中輸入FPD(Max)和收縮頻率數據，以FPD(Max)和收縮頻率值為縱坐標，時間含量為橫坐標建立直角坐標系，繪制FPD(Max)和收縮頻率隨時間變化曲線。

2 結果

2.1 他莫昔芬對心肌毒性測試結果

2.1.1 他莫昔芬對hPSC-CMs細胞FPD的作用

當添加3 μmol/mL的他莫昔芬處理3 h時，FPD(Max)數值降為0，結合收縮頻率數據可知出現心肌細胞停跳現象，18 h時，心肌細胞復跳。對照組0～48 h FPD(Max)數值在0.179～0.264范圍內。1和0.33 μmol/mL他莫昔芬的FPD值趨勢與對照組基本保持一致(圖1)。

圖1 他莫昔芬對hPSC-CMs細胞FPD的作用曲線圖

2.1.2 他莫昔芬對hPSC-CMs收縮頻率的作用

當添加3 μmol/mL的他莫昔芬處理3 h時，結合FPD(Max)數據，出現心肌細胞停跳現象，反應為收縮頻率數值降為0，18 h時，心肌細胞復跳。對照組收縮頻率在64.86～73.82次/分鐘范圍內。1 μmol/mL他莫昔芬處理下的心肌細胞收縮頻率低于對照組；0.33 μmol/mL他莫昔芬處理下的心肌細胞收縮頻率趨勢與對照組基本保持一致(圖2)。

圖2 他莫昔芬對hPSC-CMs收縮頻率的作用曲線圖

2.2 氟哌利多心肌毒性測試結果

2.2.1 氟哌利多對hPSC-CMs FPD的作用

心肌細胞FPD值對氟哌利多具有濃度依賴性，濃度越高，FPD(Max)數值越大，即QT間期長度越長。對照組0～48 h FPD(Max)數值在0.179～0.243范圍內。24 h時進行全換液，換液后各濃度與對照組基本一致(圖3)。

圖3 氟哌利多對hPSC-CMs FPD的作用曲線圖

2.2.2 氟哌利多對hPSC-CMs收縮頻率的作用

心肌細胞收縮頻率值對氟哌利多具有濃度依賴性，濃度越高，收縮頻率數值越小，結合FPD(Max)數據，氟哌利多具有降低心肌細胞收縮頻率，延長QT間期的作用。對照組收縮頻率在63.49～76.93次/分鐘范圍內。24 h時進行全換液，換液后各濃度處理的心肌細胞均有一定程度的恢復，但氟哌利多0.33和1 μmol/mL處理組收縮頻率低于對照組，氟哌利多0.11 μmol/mL處理組的收縮頻率與對照組基本保持一致(圖4)。

圖4 氟哌利多對hPSC-CMs收縮頻率的作用曲線圖

3 討論

現階段，新藥的心臟毒性主流檢測方法是應用動物模型。動物模型不僅檢測成本高、檢測周期長、效率低，并且與人體存在基因和生理等方面的種屬差異。例如，正常人體心臟搏動頻率為60～100次/分鐘，而小鼠靜息狀態下的心率是人類的10倍，因此其在預測和評價藥物的心臟毒性反應方面必然與人體存在較大偏差。因此進行新藥評價最為準確的方法就是采用人體心臟作為實驗對象，可以最真實地反映心臟對于候選藥物的響應情況，然而這在藥物臨床前研究階段是不可能實現的。

本研究主要應用hPSC-CMs建立新藥心臟毒性體外檢測方法。應用CiPA項目認定的低風險化合物他莫昔芬和中風險化合物氟哌利多作用于hPSC-CMs模型，通過檢測兩種化合物不同濃度作用hPSC-CMs后的FPD和收縮頻率的變化來判斷其心臟毒性風險程度是否符合CiPA項目的認定標準。本研究發現，他莫昔芬只有在高濃度時才能對hPSC-CMs的FPD和收縮頻率產生影響，使心肌細胞出現停跳現象；心肌細胞FPD值和收縮頻率對氟哌利多均有濃度依賴性，濃度越高，FPD(Max)數值越大，即QT間期長度越長，收縮頻率數值越小。上述結論與CiPA項目的認定標準相符，證明該方法可以準確評價低風險化合物他莫昔芬和中風險化合物氟哌利多對hPSC-CMs模型的毒性作用。

本研究建立的新藥心臟毒性體外檢測方法仍需后續通過檢測CiPA項目認定的多種低、中和高風險化合物來進一步驗證其可靠性、準確度和靈敏度。本研究的后續研究將進一步優化條件并應用建立的新藥心臟毒性體外檢測方法對待檢樣品進行檢測，同時尋找多種新藥來對其心臟毒性進行評價。