規?；i場豬源沙門氏菌的分離鑒定及藥物敏感性分析

張 海，鄧珊珊，藺俐仲，楊 源，劉 艷，景書灝，徐春志，袁 林

（1.貴陽市動物疫病預防控制中心，貴州 貴陽 550081；2.貴陽市清鎮市農業農村局，貴州 貴陽551400；3.貴陽市草地站，貴州 貴陽 550081；4.貴陽市息烽縣農業農村局，貴州 貴陽 550300）

沙門氏菌是廣泛存在于人和動物腸道內的腸桿菌科革蘭氏陰性桿菌[1]。沙門氏菌能夠引起人和畜禽全身感染和出現菌血癥，引發傷寒、副傷寒、腹瀉、發熱和腸道炎癥等癥狀[2]，食用被污染沙門氏菌的食材還可發生食物中毒。沙門氏菌血清型眾多，目前已報道的血清型有2 000多種，我國已報道的血清型有300余種[3]。引起動物腹瀉的沙門氏菌為腸道沙門氏菌，主要包括鼠傷寒沙門氏菌、豬傷寒沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌、都柏林沙門氏菌和腸炎沙門氏菌等血清型[4]。沙門氏菌抗原有菌體抗原（O抗原）、鞭毛抗原（H抗原）和莢膜抗原（表面vi抗原）。近年來，在非洲豬瘟常態化防控的形勢下，政府和養殖企業加大了對養豬業的投入，隨著生豬養殖業的發展和養殖企業趨于規模化、集約化，仔豬腹瀉的發生率越來越高。引起仔豬腹瀉的病因有病毒、細菌、寄生蟲和飼養管理等，其中細菌性腹瀉的發病率日趨嚴重，給養豬業的發展造成了較大的經濟損失。本試驗采集規?；i場腹瀉仔豬腸內容物進行細菌分離培養、生化試驗、PCR檢測、動物致病性試驗和藥敏試驗，以期為豬場腹瀉的防控提供參考。

1 材料

1.1 試驗時間與地點

試驗于2020年3—6月在貴州嘉農種豬養殖有限公司進行。

1.2 病料

采自貴陽市某豬場仔豬腹瀉病例發病仔豬的腸道內容物。

1.3 主要培養基及試劑

2×Taq PCR Master Mix、DL 2 000 DNA Marker、細菌基因組DNA提取試劑盒、瓊脂糖，購自天根生化科技有限公司；營養肉湯、營養瓊脂、麥康凱瓊脂、BS瓊脂、腸桿菌科生化鑒定管，均購自杭州微生物試劑有限公司。

1.4 藥敏紙片

青霉素、哌拉西林、氨芐西林、復方新諾明、磺胺甲異噁唑、磺胺嘧啶、氧氟沙星、諾氟沙星、環丙沙星、慶大霉素、卡那霉素、丁胺卡那霉素共12種獸醫臨床常用藥敏紙片均購自杭州微生物試劑有限公司。

1.5 試驗動物

試驗小鼠由貴州醫科大學實驗動物中心提供。

2 方法

2.1 細菌的分離培養與鏡檢

將采集腹瀉仔豬腸道內容物按照常規劃線分離細菌的方法接種于鮮血營養瓊脂培養基，37 ℃培養24 h，挑取細小、光滑、圓整、無色透明的菌落在BS培養基上進行純化培養。把純化后的細菌接種于血清肉湯中，37 ℃振蕩培養過夜，取少量菌液進行革蘭氏染色，鏡檢，余下菌液備用。

2.2 生化試驗

選擇符合沙門氏菌培養特征和染色特性的純培養物分別接種于生化反應管，37 ℃培養24 h后觀察結果。

2.3 PCR鑒定

根據沙門氏菌invA基因設計引物invA-P1：GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA；invA-P2：TCATCGCACCGTCAAAGGAACC，預期擴增片段為184 bp，引物由上海英俊公司合成。使用細菌DNA提取試劑盒提取細菌基因組DNA，將提取的細菌DNA作為模板，建立PCR反應體系為25 μL：2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL，DNA模板1.0 μL，下游引物（10 μmol/L）各1.0 μL，滅菌雙蒸水9.5 μL。擴增程序為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，59 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min；72 ℃ 延伸10 min，PCR產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2.4 動物致病性試驗

將鑒定的沙門氏菌挑菌接種于LB營養肉湯中過夜培養，測定培養后細菌菌液細菌菌落（CFU）含量。按照分離的菌株數進行分組，取質量在12 g左右的BLAB小鼠，每組9只老鼠。飼養小鼠3 d后開始致病性試驗，按0.02 mL/g腹腔注射經已鑒定純化的沙門氏菌菌液（4.1×109cfu/mL），對照組按0.02 mL/g腹腔注射無菌生理鹽水。接種后將攻毒小鼠隔離飼養，每日觀察小鼠精神狀態，記錄發病情況和死亡情況，并剖檢死亡的小鼠，無菌采集腹瀉及死亡小鼠心、肝、脾等臟器接種至血瓊脂培養基，分離鑒定細菌。

2.5 藥敏試驗

采用藥敏紙片瓊脂擴散法參照美國臨床實驗室標準化協會（Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI）制定的標準進行，取分離純培養的沙門氏菌菌液，用無菌棉拭子蘸取適量的菌液均勻涂布于營養瓊脂平板，待平板完全吸收后取藥敏紙片貼于培養基上，37 ℃培養24 h，測量抑菌圈直徑，根據杭州微生物試劑有限公司提供的標準進行抑菌效果判定。

3 結果與分析

3.1 細菌的分離培養及染色鏡檢結果

腹瀉仔豬腸道內容物劃線培養接種于血瓊脂培養基，挑取單個群落在BS瓊脂純化培養，結果在BS瓊脂培養基中可見到光滑圓整、透明、中心為黑色的菌落，見圖1。挑取BS瓊脂培養基上的黑色菌落，按照細菌染色方法進行革蘭氏染色鏡檢，結果顯示，分離菌為革蘭氏陰性短小桿菌，結果見圖2。

圖1 BS瓊脂培養結果

圖2 革蘭氏染色結果

3.2 生化試驗結果

將分離純化的沙門氏菌培養物進行生化鑒定，結果見表1。根據分離菌株的形態、培養特性和生化試驗結果，結合腸桿菌科細菌生化鑒定編碼冊的鑒定標準，判斷分離菌株1為鼠傷寒沙門氏菌，分離菌株2為豬霍亂沙門氏菌。

表1 沙門氏菌生化試驗結果

3.3 沙門氏菌PCR鑒定結果

采用細菌組DNA提取試劑盒分別提取兩株沙門氏菌基因組DNA，以提取的DNA為模板，進行沙門氏菌invA基因擴增。PCR擴增產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，兩株沙門氏菌均能擴增出特異性目的片段，大小約為184 bp（圖3）。

圖3 沙門氏菌PCR鑒定結果

3.4 動物致病性試驗結果

將分離鑒定的鼠傷寒沙門氏菌和豬霍亂沙門氏菌培養物分別注射到小鼠腹腔內，攻毒注射第1天后試驗組均出現精神萎靡、被毛蓬松、食欲減退，對照組均正常。攻毒第3天后個別小鼠出現顫栗、少數出現便血、拉稀，且試驗組有小鼠出現死亡。鼠沙門氏菌攻毒組在攻毒后第6天小鼠全部死亡，豬霍亂沙門氏菌攻毒組在攻毒后第8天全部死亡。對照組小鼠全部正常，未出現異常臨床癥狀。死亡小鼠剖檢可見腸道充血，腹腔積水，肝、脾臟有壞死點。表明兩株沙門氏菌都有較強的致病性。剖檢病死小鼠，無菌采集小鼠的肝臟和小腸內容物，接種于血瓊脂培養基，進行細菌分離培養，結果顯示分離菌與接種的細菌形態特征和培養特性均相同。

3.5 藥敏試驗結果

對分離到的2株沙門氏菌參照美國臨床實驗室標準化協會（Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI）制定的標準進行藥敏試驗，結果顯示2株沙門氏菌均對青霉素、氨芐西林和吡哌酸高度耐藥，對氧氟沙星、頭孢克洛、鏈霉素和慶大霉素敏感。

4 討論

仔豬腹瀉是生豬養殖過程中常發的疾病，危害仔豬的生長發育，常常是多種誘因混合，嚴重者可導致仔豬發生死亡。引起仔豬發生細菌性腹瀉的主要病原菌有大腸埃希氏菌、沙門氏菌、魏氏梭菌、耶爾森菌等。臨床上發生細菌感染時，很難區分細菌的種類，需要借助于實驗室診斷技術。常見的診斷技術有細菌的傳統分離鑒定、血清學檢測和分子生物學檢測。細菌分離鑒定耗時長、步驟繁雜、容易出現錯漏，需要專業的技術人員開展。血清學檢測常用的ELISA（酶聯免疫吸附試驗）抗體檢測技術，雖然步驟簡單、用時短，但是沙門氏菌血清型眾多，很難區分具體的血清型。分子生物學中常用的方法是PCR和熒光PCR檢測方法，熒光PCR檢測方法耗時更短、結果準確，但是儀器設備昂貴、對環境條件要求較高。傳統分離鑒定、血清學檢測和分子生物學檢測方法都各有特點，各有弊端，在基層的診斷過程中我們常常將傳統分離鑒定和分子生物學檢測方法相結合，以更快地進行診斷。

發生疾病后，準確快速的診斷，選擇敏感的藥物是關鍵。合理用藥，選擇多種藥物交替使用，能夠降低細菌產生耐藥性的幾率。引起仔豬腹瀉的病因不光是病原微生物方面的，更重要的飼養管理方面的因素，如環境衛生差、豬舍通風換氣效果差、飼喂發霉變質飼料等原因引起的仔豬免疫力下降，都會誘發仔豬發生腹瀉。貴州地區環境濕度大、晝夜溫差大、一年四季多雨，很容易造成飼料發生霉變，因此要加強飼養管理，做好環境清潔、豬舍保溫和環境消毒，減少豬群應激。