低頻超聲聯(lián)合5-FU對結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞生物學(xué)特性的影響

李 艷,羅栩偉,朱冬梅,楊 姣,張英娟,張 慧,陳思佳,劉 剛,劉學(xué)彬*

(1南充市中心醫(yī)院,川北醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院超聲科,南充 637000;2南充市中心醫(yī)院,川北醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院骨科；*通訊作者,E-mail:540677374@qq.com)

結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)是世界上第三大常見癌癥,目前化療仍然是結(jié)腸癌患者的一線治療方法,但由于耐藥性的產(chǎn)生,結(jié)腸癌易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移,死亡率仍然居高不下[1,2]。研究發(fā)現(xiàn)[3-5]腫瘤細(xì)胞中有一小群具有干性的細(xì)胞,在腫瘤異質(zhì)性的形成和獲得抗藥性中起關(guān)鍵作用,被稱為腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells,CSCs),是影響結(jié)腸癌耐藥性獲得和復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移過程的主要原因。因此,靶向結(jié)腸癌中的腫瘤干細(xì)胞是改善結(jié)腸癌患者的治療療效和生存期的關(guān)鍵。

聲動力療法(sonodynamic therapy,SDT)是一種新興的抗腫瘤方法,近年來在癌癥治療中受到重視[6,7]。其中,低頻超聲(low-frequency ultrasound,LFUS)由于空化效應(yīng),可在細(xì)胞膜上形成小孔,增加大分子物質(zhì)的攝取,也可誘導(dǎo)敏感細(xì)胞發(fā)生凋亡,同化療藥物聯(lián)合使用,可以產(chǎn)生更好的協(xié)同抗腫瘤效果而受到研究者們的青睞[8,9]。在本研究中,我們假設(shè)LFUS對結(jié)腸癌細(xì)胞的刺激可以增強(qiáng)其對化療藥物治療的敏感性,比較有無LFUS刺激的細(xì)胞增殖、凋亡差異以及CSCs集落的形態(tài)變化等。這將為結(jié)腸癌的治療提供一種新的思路和治療方法。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

人結(jié)腸細(xì)胞系HT-29(購自武漢中國細(xì)胞研究中心);無血清高糖細(xì)胞DMEM培養(yǎng)基(美國Hyclone公司);10 000 U/ml penicillin和10 000 μg/ml streptomycin(美國Hyclone公司);磷酸鹽緩沖液(PBS)(美國Hyclone公司);胎牛血清(FBS)(美國Hyclone公司);0.25%胰酶(美國Hyclone公司);BCA蛋白定量試劑盒(Thermo Fisher);CCK-8試劑盒(中國江蘇凱基生物科技股份有限公司);總RNA提取試劑盒(中國TIANGEN生化科技有限公司);細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Thermo公司);核酸擴(kuò)增儀(美國Thermo公司);BIO-RAD實時熒光定量PCR儀(ICYCLER IQ5)(美國Bio-Rad公司);核酸微量分光光度計(德國Eppendorf公司);旋渦震蕩器(德國Eppendorf公司);高低速離心機(jī)(美國Thermo公司);超聲發(fā)生器(UP50H)(德國Hielscher)。

1.2 實驗方法

1.2.1 人結(jié)腸癌的普通培養(yǎng) 人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM完全培養(yǎng)液(含10%胎牛血清,100 U/ml青霉素,100 μg/ml鏈霉素)。將HT-29細(xì)胞置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),0.25%的胰酶消化細(xì)胞,隔2-3 d傳代1次,取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行腫瘤干細(xì)胞球的培養(yǎng)以及細(xì)胞增殖實驗。

1.2.2 無血清懸浮培養(yǎng)法(serum-free medium,SFM)富集腫瘤干細(xì)胞 收集對數(shù)生長期的HT-29細(xì)胞,PBS洗滌兩次除去血清,然后用無血清培養(yǎng)基DMEM/F12(Dulbecco’s Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12)重懸細(xì)胞接種到超低黏附的6孔培養(yǎng)板中,培養(yǎng)3 d。DMEM/F12培養(yǎng)基中含非必需氨基酸,N2添加劑(Invitrogen公司),B27添加劑(Invitrogen公司),表皮生長因子(EGF)(20 ng/ml,Invitrogen公司)和堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF,10 ng/ml,Invitrogen公司)。

1.2.3 低頻超聲刺激細(xì)胞 采用30 kHz的超聲發(fā)生器(UP50H,Hielscher,Germany)連接超聲探頭(MS1,Hielscher,Germany)用于刺激細(xì)胞。將要進(jìn)行低頻超聲刺激的培養(yǎng)板用封口膠四周封緊,固定在泡沫板上,使其能漂浮于水中,培養(yǎng)板底部完全暴露于超聲環(huán)境中。將板在30 kHz、密度為1 W/cm2中連續(xù)超聲1 min,溫度控制在37 ℃。將要進(jìn)行超聲的細(xì)胞傳在同一細(xì)胞培養(yǎng)板,非超聲處理的細(xì)胞傳在另外的培養(yǎng)板上。

1.2.4 CCK-8檢測細(xì)胞活性 收集對數(shù)生長期的HT-29細(xì)胞,消化后制備HT-29細(xì)胞懸液,再以每孔1×103個/100 μl的細(xì)胞懸液接種于96孔板中,培養(yǎng)24 h后,檢測處理前各組細(xì)胞活性,然后處理細(xì)胞。低頻超聲組:30 kHz,1 W/cm2×1 min超聲處理,僅刺激一次;5-FU組:藥物濃度為10 mg/ml培養(yǎng)24 h;聯(lián)合組:疊加處理因素;對照組:不做處理。處理后24,48,72,96 h進(jìn)行CCK-8檢測。CCK-8檢測細(xì)胞活性方法:加入10 μl CCK-8溶液到90 μl培養(yǎng)基中,置換到所需檢測的各孔中,37 ℃孵育1 h,然后使用酶標(biāo)儀測定450 nm波長處的各孔光吸收值。

1.2.5 低頻超聲和5-FU對CSCs的影響 為了評價和比較低頻超聲和5-FU對CSCs的影響,采用超低黏附6孔板培養(yǎng)CSCs,在集落形成3 d后,對照組僅換為新鮮的DMEM/F12培養(yǎng)基,不做其他處理;低頻超聲組,換液后將細(xì)胞暴露于LFUS刺激,每天刺激一次,連續(xù)2 d;5-氟尿嘧啶(5-FU)組,換入含5 μg/ml 5-FU的DMEM/F12培養(yǎng)基;聯(lián)合組(低頻超聲+5-FU),疊加上述處理即換入含5 μg/ml 5-FU的DMEM/F12培養(yǎng)基,并且每天LFUS刺激一次,連續(xù)2 d。每組3個復(fù)孔,并進(jìn)行獨立實驗3次。

1.2.6 熒光定量PCR技術(shù)檢測基因表達(dá)水平 按照總RNA提取試劑盒說明書,提取處理后的腫瘤干細(xì)胞球的總RNA,經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。應(yīng)用熒光定量PCR(qRT-PCR)技術(shù)檢測各組細(xì)胞干性相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平。本研究用CD133、CD44和Sox2的表達(dá)水平來表征結(jié)腸癌腫瘤干細(xì)胞干性的變化。引物序列見表1,GAPDH為內(nèi)參基因。反應(yīng)條件為:95 ℃預(yù)熱15 min;94 ℃變性15 s,55 ℃退火30 s,60 ℃延伸30 s,共35個循環(huán)。每個反應(yīng)孔的熒光信號達(dá)到設(shè)定閾值時的循環(huán)數(shù)即為Ct值。對檢測得到的Ct值以相對定量的方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析:miRNA的相對表達(dá)量用2-ΔΔCt來計算。每個基因重復(fù)反應(yīng)3次,進(jìn)行獨立實驗3次。

表1 引物序列

1.2.7 蛋白印跡(Western-blotting)檢測蛋白表達(dá)情況 經(jīng)過處理后的腫瘤干細(xì)胞轉(zhuǎn)移至離心管,2 000 r/min離心5 min,收集細(xì)胞沉淀,加入細(xì)胞裂解液提取蛋白樣品,BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行定量。取等量蛋白樣品進(jìn)行10%十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離后,轉(zhuǎn)移至醋酸纖維膜(NC)上,5%脫脂奶粉常溫封閉1 h,加一抗4 ℃過夜,洗膜后加二抗孵育1 h。一抗(均購自美國Abcam公司)包括:鼠抗人甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH,1∶2 000),兔抗人PARP(1∶100),兔抗人Bcl-2(1∶1 000),兔抗人CD133(1∶1 000),兔抗人CD44(1∶1 000)。常規(guī)增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法曝光、掃描成像。

1.2.8 統(tǒng)計學(xué)分析 使用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行,計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的方法表示,兩組間采用t檢驗,多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析以及SNK檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 低頻超聲聯(lián)合5-FU抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖

經(jīng)低頻超聲和5-FU聯(lián)合處理后,結(jié)腸癌細(xì)胞變圓、皺縮、喪失細(xì)胞形態(tài),與對照組相比有明顯差異(見圖1A)。CCK-8檢測結(jié)果顯示,與對照組和單獨處理組比較,低頻超聲和5-FU聯(lián)合處理組細(xì)胞增殖明顯受到抑制,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,見圖1B)。

圖1 低頻超聲和5-FU抑制HT-29細(xì)胞增殖

2.2 低頻超聲聯(lián)合5-FU抑制結(jié)腸癌干細(xì)胞的克隆形成

與control組比較,LFUS組、5-FU組干細(xì)胞球數(shù)量差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義。與control組相比,LFUS和5-FU聯(lián)合處理組干細(xì)胞球體松散,且個體小,數(shù)量顯著減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,見圖2A)。提取處理48 h的干細(xì)胞球總RNA和蛋白,通過qRT-PCR和Western blot檢測干性相關(guān)基因CD133、CD44和Sox2的mRNA水平和蛋白表達(dá)水平,結(jié)果表明與control組比較,LFUS和5-FU聯(lián)合處理后干細(xì)胞球的干性CD133、CD44和Sox2的mRNA水平下調(diào),同時檢測到CD133、CD44蛋白表達(dá)水平也降低(見圖2B和2C)。因此,我們認(rèn)為低頻超聲聯(lián)合5-FU能明顯抑制結(jié)腸癌干細(xì)胞的克隆形成。

圖2 低頻超聲、5-FU以及聯(lián)合組對HT-29 CSCs形成的影響

2.3 低頻超聲促進(jìn)5-FU誘導(dǎo)結(jié)腸癌干細(xì)胞凋亡

將經(jīng)過處理的CSCs細(xì)胞用Acctuase酶(Sigma公司)消化成單個細(xì)胞后進(jìn)行凋亡檢測,對照組的凋亡率為(4.38±1.27)%,低頻超聲組的凋亡率為(4.45±1.56)%,5-FU組的凋亡率為(8.2±1.76)%,聯(lián)合組的凋亡率為(12.27±1.63)%。低頻超聲組和5-FU組細(xì)胞凋亡率與對照組相比,差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義;與對照組和單獨應(yīng)用低頻超聲組相比,LFUS和5-FU聯(lián)合組凋亡率顯著增加,且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,見圖3)。進(jìn)一步Western blot檢測結(jié)果顯示,與對照組和低頻超聲組相比,LFUS和5-FU聯(lián)合組凋亡蛋白PARP(poly ADP-ribose polymerase)裂解片段(cleaved-PARP)明顯增加,同時BCL蛋白家族中的抑凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)下調(diào)(見圖4)。以上結(jié)果提示,低頻超聲可促進(jìn)5-FU誘導(dǎo)結(jié)腸癌干細(xì)胞發(fā)生凋亡。

左下象限(Q4)顯示活細(xì)胞,呈現(xiàn)Annexin Ⅴ-/PI-;右下象限(Q3)為早期凋亡細(xì)胞,呈現(xiàn)Annexin Ⅴ+/PI-;右上象限(Q2)為晚期凋亡細(xì)胞,呈現(xiàn)Annexin Ⅴ+/PI+;左上象限(Q1)為壞死細(xì)胞,呈現(xiàn)Annexin Ⅴ-/PI+

圖4 Western bolt檢測凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)情況

3 討論

近年來,超聲被報道為最好的藥物釋放觸發(fā)技術(shù)之一,在腫瘤治療研究中凸顯光芒,這是因為它是一種低成本的非侵入性技術(shù),可以精確地作用于腫瘤組織[10,11]。超聲的治療作用分為熱療和非熱療,其中由低頻超聲產(chǎn)生的非熱空化機(jī)械效應(yīng)具有穿透力強(qiáng)、組織損傷小、對惡性腫瘤細(xì)胞敏感等優(yōu)點,因此低頻超聲在腫瘤治療中具有明顯優(yōu)勢[12,13]。LFUS可以提高化療藥物的抗癌活性,包括阿霉素[14]、順鉑[15]、5-氟尿嘧啶[16]、環(huán)磷酰胺[17]和多西紫杉醇[18],可能的機(jī)制是通過超聲波的空化作用,形成聲致孔現(xiàn)象改變了細(xì)胞膜和組織膜的通透性。并且,研究表明[19,20]低頻超聲能夠提高包封后的腫瘤靶向藥物在腫瘤的局部濃度,從而抑制腫瘤細(xì)胞耐藥,提高療效。

化療是結(jié)腸癌患者的一線治療方案,如5-FU可以殺傷普通的腫瘤細(xì)胞,但是腫瘤干細(xì)胞對化療藥卻不敏感,這也是導(dǎo)致治療失敗的關(guān)鍵因素[21]。腫瘤干細(xì)胞和正常干細(xì)胞一樣具有自我更新的能力,對常規(guī)化療和放射治療具有抵抗力,在促使腫瘤復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移過程中起主要作用[22,23]。Oct4和Sox2是常見的干細(xì)胞相關(guān)蛋白,并且Oct4和Sox2蛋白在CSCs中的表達(dá)高于正常癌細(xì)胞群體。研究表明[24],CD133和CD44在結(jié)腸癌干細(xì)胞中高表達(dá)。因此,本研究用CD133、CD44和Sox2的表達(dá)水平來表征結(jié)腸癌腫瘤干細(xì)胞的干性的變化。促進(jìn)CSCs向正常的癌細(xì)胞轉(zhuǎn)化,以消除其自我更新能力、增強(qiáng)CSCs對化學(xué)藥物敏感性,是近年抗腫瘤治療研究的熱點之一[25-27]。本項研究聯(lián)合低頻超聲和5-FU用于抗結(jié)腸癌,結(jié)果表明低頻超聲可以顯著增強(qiáng)5-FU抗結(jié)腸癌細(xì)胞活性,使結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞變圓、皺縮、喪失細(xì)胞形態(tài)。有趣的是,我們觀察到LFUS和5-FU聯(lián)合處理組干細(xì)胞球體松散,且個體小,數(shù)量顯著減少,qRT-PCR和Western blot結(jié)果提示LFUS和5-FU聯(lián)合處理可顯著降低結(jié)腸癌干細(xì)胞的干性基因CD133、CD44和Sox2的表達(dá)水平。

腫瘤細(xì)胞受相關(guān)致癌基因的調(diào)控常常表現(xiàn)出抗凋亡的性質(zhì),影響細(xì)胞的正常代謝更新。研究者們[28]通過研究抗腫瘤療法/藥物是否能夠抑制甚至逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的抗調(diào)亡能力或者誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的調(diào)亡來評估該療法/藥物在臨床中的應(yīng)用前景。PARP是細(xì)胞凋亡核心成員半胱天冬酶(Caspase)的切割底物,對于細(xì)胞的穩(wěn)定和存活非常重要,PARP失去酶活力會加速細(xì)胞的不穩(wěn)定。另外,Bcl-2蛋白是Bcl-2原癌基因的編碼產(chǎn)物,Bcl-2能夠阻止細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì),從而抑制了細(xì)胞凋亡。通常,PARP剪切以及Bcl-2表達(dá)下調(diào)被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡的重要指標(biāo)[29]。

本研究進(jìn)一步經(jīng)過流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)經(jīng)聯(lián)合處理的結(jié)腸癌干細(xì)胞凋亡率顯著增加,同時凋亡相關(guān)蛋白PARP和Bcl-2也出現(xiàn)了凋亡相應(yīng)的變化,那么表明低頻超聲可以明顯增強(qiáng)5-FU誘導(dǎo)的結(jié)腸癌干細(xì)胞凋亡。但是本研究未對LFUS誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和影響腫瘤干細(xì)胞克隆形成能力降低的分子機(jī)制進(jìn)行詳細(xì)的研究,LFUS的刺激是否抑制CSCs的自我更新能力并誘導(dǎo)腫瘤干細(xì)胞分化為普通癌細(xì)胞而增強(qiáng)了對5-FU的敏感性還需要進(jìn)一步研究。值得指出的是,腫瘤干細(xì)胞的自我更新能力在腫瘤干細(xì)胞克隆形成、腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程中起著重要作用,那么未來降低腫瘤干細(xì)胞的干性和侵襲能力,并增強(qiáng)其對化療藥物治療的敏感性,阻斷參與腫瘤干細(xì)胞自我更新和維持的通路對于抗腫瘤治療至關(guān)重要。

4 結(jié)論

綜上所述,本研究結(jié)果表明低頻超聲聯(lián)合5-FU可以顯著抑制結(jié)腸癌細(xì)胞活性,降低結(jié)腸癌干細(xì)胞的干性并促進(jìn)其凋亡,從而增強(qiáng)結(jié)腸癌細(xì)胞對化療藥物的敏感性,這為結(jié)腸癌的臨床治療提供了另一種思路,也為低頻超聲聯(lián)合低劑量的化療藥進(jìn)行抗腫瘤治療奠定研究基礎(chǔ)。