升降散加減方治療IgAN大鼠作用機制探討

張圓圓 靳培培 郭登洲

IgA腎病(immunoglobulin a nephropathy，IgAN)是指以IgA或以IgA為主的免疫復合物沉積于腎小球系膜區，臨床表現以血尿，伴或不伴蛋白尿為主的病理綜合征[1]。IgAN治療方面，西醫多以血管緊張素轉換酶抑制劑、血管緊張素受體拮抗劑控制血壓、減少尿蛋白，應用糖皮質激素、免疫抑制劑等治療為主，而傳統中醫雖對IgAN沒有明確的記載，但根據其臨床表現將其歸于“尿血”“腰痛”“水腫”“虛勞”等疾病的范疇，以其獨特的理論作指導來辨證論治本病，如《血證論·尿血》中提到“膀胱與血室并域而居，熱入血室則蓄血，熱結膀胱則尿血，尿乃水分之病，而亦干動血分者，以與血室并居，故相連累也”。可見濕熱常見于IgAN的發生發展過程中。本實驗通過觀察疏通三焦、清熱利濕理論指導的升降散加減方對IgAN大鼠24小時尿蛋白定量(24 hours urinary total protein，24h-UTP)，血清肌酐(serum creatinine，Scr)、血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、血清白蛋白(albumin，ALB)、轉化生長因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)、白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、半乳糖缺乏的IgA(galactose deficient IgA，Gd-IgA)表達水平的影響以及IgAN大鼠腎臟組織病理的變化，來了解升降散加減方可能的作用機制，為臨床治療本病提供實驗理論依據。

1 材料與方法

1.1 動物與藥物

于河北醫科大學動物實驗中心購進48只雄性SD大鼠，健康清潔級，體重(150±10)g，動物合格證編號：1805044，許可證號：SCXK(冀)2013-1-003。

升降散加減方組成：僵蠶15 g、蟬蛻15 g、杏仁12 g、陳皮12 g、茯苓15 g、炒萊菔子12 g、黃芪15 g，購自河北省中醫院中藥房，以上藥物先經蒸餾水浸泡2小時，煎煮2次(40分鐘/次)后，過濾，合并濾液加熱蒸發，依據陳奇大鼠與人藥物劑量折算方法再分別濃縮至含生藥1 g/mL水提液，制成藥液備用，每次根據老鼠體重灌服。鹽酸貝那普利片由北京諾華制藥有限公司提供。

1.2 試劑與部分儀器

牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)，購自北京索萊寶科技有限公司；脂多糖(lipopolysaccharide，LPS),購自北京索萊寶科技有限公司；四氯化碳(CCl4),購自北京索萊寶科技有限公司；蓖麻油，購自北京索萊寶科技有限公司。

尿液分析儀(美國CLINITEK50)(全自動洗板機8×12，美國)、全自動生化分析儀(Japan，Sysmex HEMIX-180)、離心機(上海安亭，TDL-5-A)、實時熒光定量PCR儀(BIO-RAD CFX96)、酶標儀(Thomer Fisher MK FC)、電熱恒溫水箱(600型，天津泰斯特)等。

1.3 造模與分組給藥

將SD大鼠隨機分為正常組12只、造模組36只，進行1周適應性喂養，采用聯合BSA灌胃+尾靜脈注射LPS+皮下注射CCl4、蓖麻油的免疫復合的方法建立實驗性IgAN模型，方案如下：口服免疫原BSA劑量較常用劑量增加1倍，以600 mg/kg隔天灌胃，持續6周；CCl4注射方式由既往的腹腔注射改為皮下注射，皮下注射蓖麻油0.5 mL+CCl40.10 mL，每周1次，持續9周，并聯合運用LPS，分別于第6、8周尾靜脈注射LPS 0.05 mg。模型制作成功后，將造模組大鼠隨機分成中藥組、西藥組和模型組各12只。中藥組每日灌服中藥，西藥組每日灌服1.8 mg/kg鹽酸貝那普利，模型組、正常組給予等量蒸餾水灌胃，每日1次，共8周。

1.4 采集標本與檢測指標

1.4.1 24h-UTP檢測 分別于實驗第1、9、15、19周留取24小時尿液，用全自動生化分析儀檢測，并記錄好相關數據。

1.4.2 血清指標檢測 實驗19周后，禁食12小時，禁水4小時，腹腔注射麻醉后(10%水合氯醛3.5 mL/kg)，采用股動脈采血，運用全自動生化分析儀測定Scr、BUN、ALB等指標；運用ELISA法檢測血清中TGF-β1、IL-6、Gd-IgA的含量。

1.4.3 腎組織鏡檢及免疫熒光檢查 大鼠股動脈取血后，立即將大鼠腎臟分離，將切取的腎組織用4%的多聚甲醛液進行固定，用于蘇木精—伊紅染色(hematoxylin-eosin staining，HE)、馬松染色(Masson staining，Masson)、過碘酸雪夫氏染色(schiff periodic scid shiff，PAS)、過碘酸—銀—烏洛托品(Perioddic acid silver meth enamine，PASM)常規染色的光鏡制備使用；將一部分腎臟組織迅速制成冰凍切片，用于進行免疫熒光檢測；取大小為1 mm×1 mm的腎組織于4%的戊二醛固定液中用以進行透射電鏡樣本制備。

1.5 統計學處理

2 結果

2.1 各組大鼠的一般情況

正常組大鼠毛色光亮，精神、攝食、飲水均正常，體重逐漸增加；模型組、中藥組、西藥組大鼠在造模階段出現毛色亮度降低，精神不振，進食減少，體重增加緩慢；而藥物干預治療后，中藥組、西藥組大鼠上述癥狀有所恢復。

2.2 各組大鼠24h-UTP檢測結果

實驗第1周，各組實驗大鼠尿蛋白均為陰性，組間比較無統計學差異(P>0.05)。實驗第9周，與正常組相比，模型組、中藥組、西藥組實驗大鼠24h-UTP均增高，差異有統計學意義(P<0.05)。第15、19周，與正常組相比，模型組實驗大鼠24h-UTP升高，差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組相比，中藥組、西藥組實驗大鼠24h-UTP均降低，差異有統計學意義(P<0.05); 與西藥組相比，中藥組大鼠24h-UTP 無統計學差異(P>0.05)。見表1。

表1 各組IgAN大鼠24h-UTP的變化比較

2.3 各組大鼠血清指標檢測結果

與正常組相比，各組實驗大鼠血清中Scr、BUN、ALB的含量無統計學差異(P>0.05)；與模型組相比，中藥組、西藥組實驗大鼠血清中Scr、BUN、ALB的含量無統計學差異(P>0.05);與西藥組比較，中藥組實驗大鼠血清中Scr、BUN、ALB的含量無統計學差異(P>0.05)。見表2。

表2 各組IgAN大鼠血清Scr、BUN和ALB的比較

2.4 光鏡觀察各組大鼠腎臟結構

正常組大鼠腎小球等形態結構均正常，基底膜、系膜細胞、間質細胞及胞外基質未見異常病理改變，無間質炎性細胞浸潤，血管腔清晰；模型組大鼠腎小球呈代償擴張和萎縮病變，系膜細胞和內皮細胞呈中重度增生，系膜基質表現為彌漫性增寬增厚，腎小管間質炎性細胞浸潤，呈間質纖維化，毛細血管袢阻塞；西醫組、中藥組大鼠光鏡下腎組織病理改變與模型組相似，但較模型組病理損傷較輕。見圖1～4。

2.5 電鏡觀察各組大鼠腎臟系膜區

正常組大鼠腎小球系膜區清晰，無電子致密物，基質分布均勻，足突排列有序，大小相等，基底膜厚度一致；模型組系膜細胞增生，基質增多，系膜區散在高密度電子致密物沉積，足細胞可見足突節段性融合、絨毛變性；西藥組、中藥組大鼠電鏡下見少量電子致密物沉積系膜區，足突輕度融合或不明顯，腎小球系膜細胞輕度增生，西藥組、中藥組大鼠電鏡下病理損傷較模型組有所減輕。見圖5。

注： A:正常組;B:模型組;C:西藥組;D:中藥組。

注： A:正常組;B:模型組;C:西藥組;D:中藥組。

注： A:正常組;B:模型組;C:西藥組;D:中藥組。

注： A:正常組;B:模型組;C:西藥組;D:中藥組。

注： A:正常組;B:模型組;C:西藥組;D:中藥組。

注： A:正常組;B:模型組;C:西藥組;D:中藥組。

2.6 免疫熒光法觀察各組大鼠腎臟腎小球系膜區

正常組大鼠無免疫復合物沉積于腎小球系膜區；模型組大鼠有團塊狀免疫復合物沉積于腎小球系膜區；西藥組、中藥組大鼠有不同程度的免疫復合物沉積于腎小球系膜區，但沉積量較模型組少。見圖6。

2.7 ELISA法檢測各組大鼠血清中TGF-β1、IL-6、Gd-IgA的含量

與正常組相比，模型組大鼠血清中TGF-β1、IL-6、Gd-IgA含量均明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組相比，西藥組、中藥組大鼠血清中TGF-β1、IL-6、Gd-IgA含量均下降,差異有統計學意義(P<0.05)；與西藥組相比，中藥組大鼠血清中TGF-β1、IL-6、Gd-IgA差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 各組IgAN大鼠血清中TGF-β1、IL-6 和Gd-IgA的比較

3 討論

3.1 檢測指標選擇依據

IgAN發病機制復雜，而免疫致病機制為本病的重要致病機制。IgAN的首要發病機制為IgA1異常糖基化[2]。IgA1分子正常的情況下有獨特的鉸鏈區結構，在鉸鏈區中有多個蘇氨酸、絲氨酸殘基，此為O糖基化的連接位，IgA1分子O糖基化過程中，N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)在N-乙酰半乳糖胺轉移酶的作用下與絲氨酸、蘇氨酸連接形成O糖基化的基本結構，半乳糖(Gal)在C1GalT1和分子伴侶Cosmc的催化作用下與GalNAc連接，N-乙酰神經氨酸在α-2，6唾液酸轉移酶(ST6GALNAC2)或α-2，3唾液酸轉移酶(ST3GAL)的作用下與GalNAc或Gal連接形成糖鏈[3]。而在產生IgA1的細胞中，GalNAc的唾液酸僅由ST6GALNAC2催化。IgA1分子的O-連接聚糖形成過程中，若IgA1分子鉸鏈區O -糖基化程度降低，缺乏半乳糖的GalNAc上直接連接唾液酸，此時形成的多聚糖無法被修飾則產生了Gd-IgA1，而Gd-IgA1與IgAN的發生相關[4]。Gd-IgA1可使IgA1易于自身聚集，或形成免疫復合物沉積于腎小球系膜區，此為IgA的主要發病原因[5]。Robert等[6]認為只要影響到糖基化的酶，就可能影響IgA1糖基化，C1GalT1、ST6GALNAC2即為上述過程中的關鍵酶。影響這2種酶表達或活性的因素，即能使 C1GalT1活性低并且(或者)使ST6GALNAC2活性增強就會使IgA1異常糖基化。最新研究發現， TGF-β通過下調C1GalT1和Cosmc的 mRNA水平來影響二者的產生[7]。IL-6在IgAN 患者的血清中含量升高，會降低Cosmc和C1GalT1的表達，進而影響IgA1的糖基化[8-9]。此外，IL-6還能增加ST6GalNAcⅡ 的表達。

3.2 疏通三焦，清熱利濕理論依據

IgA腎病在中醫上屬于“水腫”“血尿”等范疇，根據陳香美等[10]制作的大樣本IgAN患者中醫證候的流行病學調查顯示IgAN患者主要以“濕熱”“血瘀”兩種證候為主(31.6%、28.9%)。時振聲教授[11]也認為濕熱是導致腎病發生的主要病因病機。人體水液代謝與肺、脾、腎、三焦關系密切，肺主通調水道；脾主運化水液；腎主水，調節體內水液的潴流、分布、排泄，三焦是水液運行的通道，其中脾居中焦，主運化水液，是水液代謝的樞紐。當各種病理因素，如七情內傷等致使脾的運化受損，則會引起水液停聚為濕邪，此時若機體正氣虧虛感受外邪則會化生濕熱。濕為陰邪，其性重濁黏滯，易襲陰位，故而侵犯下焦，腎為五臟之下極，故最易受之。此外，濕邪日久亦可化熱，而濕熱可循水液運行三焦，引起肺、脾、腎三臟功能失調:濕熱壅塞上焦，則肺失宣發肅降，氣化失司，故見肢體水腫；濕熱壅塞中焦，脾失健運，中焦運化水液失司，引起惡性循環，加重濕熱；濕熱壅塞下焦，腎失封藏，五臟六腑所藏之精不固而下泄，故可見蛋白尿，濕熱蘊結于膀胱，灼傷脈絡可見血尿。

郭登洲教授結合多年臨床治療經驗及目前研究共識，認為濕熱為本病的重要病因[12-14]，而“血瘀”貫穿于IgA腎病的發生、發展整個過程中。其病機為脾胃虛弱導致水液運化失司，水液停聚，日久化熱，從而影響脾胃的正常運化，致使濕熱更勝；濕熱下注，累及下焦，水熱互結，損傷腎臟，使血溢出脈外，出現血尿，日久致使腎臟出現病理變化；同時濕熱日久，耗傷陰液，陰虧血耗，則血行遲緩，瘀血內生；“濕熱”“血瘀”兩者相互影響，共同促進疾病的發展，加重腎臟組織的損傷。因此筆者團隊認為“濕熱內蘊，瘀血阻絡”是IgAN基本證候。因此治療上當以疏通三焦，清熱利濕為原則，方用升降散加減方使三焦通暢，濕熱得以清利，從而使疾病得到有效控制以期達到治愈。

3.3 升降散加減方用藥分析

升降散加減方由僵蠶、蟬蛻、杏仁、陳皮、茯苓、炒萊菔子、黃芪組成。其中僵蠶氣輕味浮，可祛風散結，宣發氣機，開其濕熱郁結；僵蠶、蟬蛻，生發清陽以宣發諸身氣機，使郁結得開，氣機暢達；杏仁開上焦肺氣，肺宣濕開，則熱隨濕去；以陳皮通調中焦氣機，使氣機調達，給濕邪以去處；茯苓、炒萊菔子利濕通腑導下焦濕熱，使下焦通暢；黃芪補氣之不足，諸藥合用疏利三焦、清利濕熱。氣充則化濕利水，正氣足而邪不可干。課題組運用升降散加減方治療IgAN，對于減輕血尿、蛋白尿確有實效，在此基礎上進行了前期臨床觀察，結果表明升降散加減方有助于減低終點事件的發生，減少血尿、蛋白尿，治療IgAN療效確切[15]，這也進一步證明了濕熱在IgAN發病過程中起重要作用。

綜上，疏通三焦、清熱利濕理論指導下的升降散加減方可減輕IgAN大鼠腎臟的病理變化，其降低尿中蛋白及減輕腎臟病理變化的效果與貝那普利相當。可見本方對IgAN大鼠有治療作用，其作用機制可能與降低血清中TGF-β1、IL-6、Gd-IgA的含量有關。