基于網絡藥理學探討黃芪—藿香—金銀花配伍預防新型冠狀病毒肺炎的機制研究

劉子豪 來曉磊 劉紅旭

2019年12月以來，全球各國陸續出現新型冠狀病毒肺炎病例，并進一步蔓延，世界衛生組織已宣布新型冠狀病毒肺炎為大流行病[1]。截至2020年6月16日8時，根據美國約翰霍普金斯大學發布的實時統計數據顯示[2]，全世界共有200余個國家和地區累計確診病例超過800萬例，累計死亡超過43萬例。

國家衛生健康委及國家中醫藥管理局先后頒布診療方案[3]，針對本病的不同證型辨證施治，并多次提出中醫“治未病”要廣泛參與到此次疫情防治之中。中醫學認為在未病之時如果能夠采取一定的手段，可以對預防疾病起到一定的作用。《素問·四氣調神大論篇》云“是故圣人不治已病治未病，不治已亂治未亂”[4]，提出“治未病”的概念。《素問·刺法論篇》云“正氣存內，邪不可干”，強調“正氣”在預防疾病中的重要地位。目前針對本次新型冠狀病毒肺炎的中醫認識較為統一[5-7]，疾病歸屬于“疫癘”范疇，其病因屬性為“濕毒之邪”，病機為“濕、毒、瘀、閉、虛”，病位在肺、脾。由此推測，以扶正、化濕、解毒為立法的中藥處方可以起到預防新冠肺炎的作用。

眾多國醫大師也積極參與此次疫情防治，筆者前期對國醫大師已公布的預防處方進行總結、分析，周仲瑛、孫光榮、唐祖宣、李佃貴、金世元、王琦、熊繼柏、劉祖貽等國醫大師開具了預防用方，以益氣、化濕、清解為主要立法，其中黃芪、藿香、金銀花為核心處方用藥[8]。《素問·評熱論篇》云“邪之所湊，其氣必虛”，正氣是抵御外邪的核心，正氣充足則外邪不易傷人。北京市第5版新冠肺炎中醫藥防治方[9]中成人代茶飲方使用了黃芪、藿香；兒童代茶飲方使用了金銀花。蔣燕君等[10]對中國各地公布的預防處方進行數據分析同樣發現黃芪為預防新冠肺炎的核心用藥。此次新冠肺炎屬“濕毒疫”[11]，化濕、解毒是主要預防和治療方法。方中黃芪益氣扶正，藿香芳香化濕，金銀花清熱解毒，三藥聯用可扶正祛邪，直中病機，從而起到未病先防之用。

常態化疫情防控之下，目前尚無特效藥物問世，疫苗仍處于臨床試驗階段，在做好個人防護的同時，能否通過“中醫治未病”的參與起到預防新型冠狀病毒肺炎的作用值得臨床研究。本研究擬通過網絡藥理學篩選出黃芪、藿香、金銀花3味藥物的作用靶點，預測其核心活性化合物，并運用分析軟件對藥物—化合物—靶點以及靶點—信號通路進行分析，探索其預防新型冠狀病毒肺炎的潛在作用機制，為抗新冠肺炎藥物開發和臨床防治應用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 藥物化學成分的收集

應用中藥系統藥理學數據庫及分析平臺(http://tcmspw.com/tcmsp.php)[12]，以“黃芪”“藿香”“金銀花”為關鍵詞檢索藥物相關活性化合物。以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%、類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18、藥物半衰期(drug half-life，HL)≥10為篩選條件，最終得到符合條件的化合物。

1.2 靶點基因名的校正及藥物—化合物—靶點網絡的構建

應用中藥系統藥理學數據庫及分析平臺獲取黃芪、藿香、金銀花3味藥物主要活性化合物的關聯靶點，應用UniProt數據庫[13](http://www.uniprot.org)校正靶點基因名稱。以“coronavirus disease 2019” “novel coronavirus pneumonia”等為關鍵詞在GeneCards網站(http://www.genecards.org)檢索新型冠狀病毒肺炎相關基因，在String在線數據庫(http://www.string-db.org)導入靶點基因，設定屬性為人類。收集化合物靶點基因與新型冠狀病毒肺炎基因的共同靶點，并繪制韋恩圖。結果導入Cytoscape 3.7.1軟件進行藥物—化合物—靶點網絡構建，實現可視化。

1.3 靶點蛋白互作網絡的構建

利用String在線數據庫對共同靶點的進行蛋白互作分析，將靶點信息導入String數據庫，物種選擇“Homo sapiens”，以蛋白互作綜合得分>0.4為篩選條件，獲取共同靶點蛋白互作信息及可視化網絡圖。

1.4 靶點通路分析

應用R(https://www.r-project.org/)語言軟件及Bioconducter生物信息軟件包(https://www.bioconductor.org/)，導入靶點基因，進行靶點基因本體功能及基因組數據庫通路富集分析，保留P<0.05的結果。得到黃芪—藿香—金銀花有效化合物作用靶點的主要生物功能和過程以及相關通路，選取前20個條目進行可視化處理。最后運用Cytoscape軟件構建靶點—信號通路網絡圖。

2 結果

2.1 活性化合物的篩選

通過中藥系統藥理學數據庫及分析平臺檢索到黃芪、藿香、金銀花中化合物417個，其中黃芪87個、藿香94個、金銀花236個；以OB≥30%、DL≥0.18且HL≥10為閾值篩選條件，得到活性成分24個。其中MOL000098-quercetin為黃芪、藿香、金銀花共有化合物；MOL000422-kaempferol為黃芪、金銀花共有化合物。刪除重復項共21個活性成分。見表1。

2.2 疾病相關靶點篩選

從中藥系統藥理學數據庫及分析平臺中獲取活性化合物相關靶點181個，從Genecards數據庫中篩選得到新型冠狀病毒肺炎相關靶點259個，兩者相映射得到42個共同靶點，并繪制韋恩圖。結果見表2、圖1。

表1 黃芪、藿香、金銀花化合物基本信息

續表

表2 黃芪、藿香、金銀花和新型冠狀病毒 肺炎重合靶點信息

2.3 藥物—化合物—靶點網絡分析

將已篩選的有關活性化合物及靶點構建表格，導入Cytoscape軟件，對不同化合物進行屬性命名，構建藥物—化合物—靶點網絡圖，結果見圖2。其中粉色代表疾病新型冠狀病毒肺炎，綠色代表黃芪、藿香、金銀花3味藥物，黃色代表活性化合物，藍色代表靶點。藥物活性化合物中等級(degree)值排列前5位的分別是：槲皮素(quercetin，MOL000098，degree值為152)、山奈酚(kaempferol，MOL000422,degree值為39)、木犀草素(leteolin，MOL000006，degree值為36)、尼泊爾鳶尾異黃酮(irisolidone，MOL005916，degree值為16)、芒柄花黃素(formononetin，MOL000392,degree值為14)；主要靶點中degree值排列前5位的分別是PTGS2(degree值為18)、PTGS1(degree值為15)、PPARG(degree值為14)、NOS2(degree值為10)、MAPK14(degree值為7)。

圖1 黃芪、藿香、金銀花和新型冠狀病毒肺炎

2.4 靶點蛋白互作網絡分析

在String在線數據庫上輸入42個共同靶點，分析后得到蛋白互作網絡圖，見圖3。該網絡圖含有42個靶點及513條邊，平均度值為24.4。其中，各節點表示作用靶點，每條邊表示各靶點之間的相互作用關系，邊數越多表示該節點對應的作用靶點越重要。

2.5 靶點通路分析

基因本體論生物功能主要包括生物過程(biology process，BP)、細胞組成(cell component，CC)和分子功能(molecular function，MF)3個部分。將共同靶點進行基因本體論生物功能分析，以P<0.05為篩選條件，共獲得基因本體論生物功能1470條，根據生物過程、細胞組成和分子功能分別選取前20個條目(細胞組成滿足條件的僅10條)進行可視化分析，見圖4～6，圖中縱坐標表示條目名稱，橫坐標表示富集個數。圖4顯示共同作用靶點生物過程集中在細菌反應、脂多糖應答、細菌來源分子反應等；圖5顯示共同靶點在細胞組成中集中于膜筏、膜微區、膜區等；圖6顯示共同作用靶點分子功能集中于細胞因子受體結合、細胞因子活性、受體配體活性等。

圖2 黃芪—藿香—金銀花配伍預防新冠肺炎藥物—化合物—靶點網絡關系圖

圖3 黃芪—藿香—金銀花配伍預防新冠肺炎靶點蛋白互作網絡關系圖

注：縱坐標表示條目名稱；橫坐標表示富集個數。

注：縱坐標表示條目名稱；橫坐標表示富集個數。

注：縱坐標表示條目名稱；橫坐標表示富集個數。

2.6 靶點的基因組數據庫通路分析

對42個共同靶點進行基因組數據庫通路富集分析，以P<0.05為篩選條件，對排列前20位的通路進行可視化分析，得到通路富集分析柱狀圖，見圖7。圖中縱坐標表示通路名稱，橫坐標表示富集的個數。共同靶點主要富集于AGEs-RAGE信號通路、甲型流感通路、白介素-17信號通路、人巨細胞病毒感染、腫瘤壞死因子信號通路、美國錐蟲病通路、卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染通路等。

2.7 靶點—通路網絡構建

將獲得的基因組數據庫通路條目和共同靶點信息導入Cytoscape軟件，繪制靶點—通路網絡圖，見圖8。圖中藍紫色圖標代表相關靶點，淺綠色圖標代表相關通路。其等級值排列前5位的核心靶點為MAPK1、RELA、MAPK8、PRKCB、PRKCA。

注：縱坐標表示通路名稱；橫坐標表示富集的個數。

注：藍紫色圖標代表相關靶點；淺綠色圖標代表相關通路。

3 討論

《黃帝內經·素問》云“疫癘乃天之邪氣，若吾身正氣內固，則邪不可干，故不相染也”，“正氣存內，邪不可干，邪之所湊，其氣必虛”。正氣是人體抵御外邪的重要部分，筆者前期對國醫大師公布的預防處方分析，多以益氣、化濕、清解為核心思路，黃芪、藿香、金銀花為核心用藥。本研究采用網絡藥理學的研究方法，應用中藥系統藥理學數據庫及分析平臺對黃芪、藿香、金銀花三味中藥的有效活性化合物進行篩選，應用GeneCards數據庫對疾病靶點進行篩選，構建活性成分—靶點網絡，應用String在線數據庫構建蛋白互作網絡，并應用Bioconducor程序包進行靶點基因本體及基因組數據庫通路富集分析，構建靶點—信號通路網絡。本研究共篩選出活性化合物21個，相關靶點181個，與新型冠狀病毒肺炎重合靶點42個，基因組數據庫通路144個，說明黃芪—藿香—金銀花配伍預防新型冠狀病毒肺炎具有多成分、多靶點、多通路的特點。

化合物中活性最強的是槲皮素、山奈酚、木犀草素、尼泊爾鳶尾異黃酮和芒柄花黃素。槲皮素具有抗病毒、抗炎、抗感染、抗腫瘤、抗氧化、清除自由基、免疫調節等多種作用，并且對肺、支氣管損傷具有保護作用[14-15]。湯海等[16]研究表明槲皮素可通過抑制Janus激酶2/信號轉導和轉錄激活因子3 (Janus kinase 2/signal transducer and activator of transcription 3，JAK2/STAT3)信號通路激活而改善氣體交換功能，抑制炎性介質的釋放，從而減輕脂多糖誘導的急性肺損傷。魏萍等[17]研究發現槲皮素可以降低轉化生長因子β1、α-平滑肌肌動蛋白和腫瘤壞死因子-α等表達，抑制大鼠肺泡細胞凋亡，降低大鼠肺組織炎癥和纖維化損傷。萬巧鳳等[18]報道槲皮素可通過抑制細胞凋亡效應酶Caspase-3活性在體外發揮抗甲型流感病毒作用。Kumar P等[19]實驗發現槲皮素可通過減少氧化應激誘導進而保護流感病毒感染的小鼠肺組織。山奈酚具有抗癌、抗氧化、抗病毒、抗炎、抗菌、增強機體免疫等多種藥理作用[20]。趙妍[21]研究發現山奈酚可以減輕脂多糖導致的小鼠急性肺損傷。DONG X等[22]發現山奈酚可通過降低絲裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)、核因子-κB等通路的活性來抑制腫瘤壞死因子-α、白介素-6、白介素-10、、白介素-1β、血管細胞黏附分子-1、細胞間黏附分子-1的表達水平，發揮抗炎作用。張偉賢等[23]發現山奈酚可通過抑制Jun氨基末端激酶磷酸化，降低肝細胞氧化應激, 保護線粒體功能，抵抗DNA斷裂誘發細胞凋亡，從而減輕肝細胞損傷。木犀草素具有抗氧化、抗菌、抗炎、神經保護和抗過敏的特性[24]。有研究[25-26]發現木犀草素可以通過減少活性氧和活性氮的生成，影響花生四烯酸的代謝和多種炎性信號通路，抑制炎性細胞因子和炎癥介質的表達，從而減輕炎癥反應。鄧東沅等[27]發現體外環境下，甲型流感病毒感染A549細胞激活凋亡通路后,木犀草素能通過降低相關基因表達,干預細胞凋亡，發揮抑制流感病毒的作用。芒柄花黃素具有抗炎、調節代謝、調節雌激素、降壓等作用[28-29]。楊雅靜[30]研究發現芒柄花黃素可提高小鼠固有免疫細胞的吞噬功能及溶菌酶的殺菌活性，提升小鼠體液免疫能力。多位學者[31-36]應用網絡藥理學研究發現不同中藥處方如清肺排毒湯、藿香正氣口服液、連花清瘟膠囊、達原飲中均含有槲皮素、山奈酚、木犀草素、尼泊爾鳶尾異黃酮等有效活性成分，研究者應用分子對接技術發現上述成分與2019新型冠狀病毒3CL水解酶的結合能同目前臨床推薦應用的新型冠狀病毒肺炎治療用藥洛匹那韋、瑞德西韋等藥物基本相似。

靶點—信號通路網絡圖中，等級值前5位的靶點分別是MAPK1、RELA、MAPK8、PRKCB、PRKCA。MAPK1和MAPK8同歸屬于MAPK家族成員，在包括氧化應激、DNA損傷、癌癥發展和病毒感染在內的環境應激下被激活[37]。WANG C等[38]研究發現細胞可通過蛋白調控抑制MAPK，從而抑制病毒的有關活動。RELA是核因子-κB轉錄因子的一個亞基，其通過誘導免疫細胞、炎癥細胞基因的表達，參與炎癥反應的調控,與中性粒細胞密不可分。活化的中性粒細胞能夠分泌γ-干擾素、白介素-6等炎性因子，升高腫瘤壞死因子-α等趨化因子，能加重炎癥反應[39]。TIAN B等[40]研究也發現RELA與病毒引起的呼吸道炎癥有關。陳民利等[41]研究發現RELA在急性肺損傷大鼠肺組織中表達增加，提示抑制RELA表達可能對急性肺損傷有改善作用。TPRKCB和PRKCA屬于蛋白激酶C家族，在細胞的代謝、凋亡、轉錄調控等多種生物學過程中發揮著重要作用。Kennedy SG等[42]研究發現，蛋白激酶C的激活能抑制細胞凋亡。

靶點基因本體富集分析結果中，生物過程集中于脂多糖應答、生物刺激反應、細胞凋亡信號通路的調控、氧化應激反應等方面，分子功能集中于細胞因子受體結合、細胞因子活性、受體配體活性、趨化因子結合、腫瘤壞死因子結合等方面。推測這些生物過程和分子功能在黃芪—藿香—金銀花預防新型冠狀病毒肺炎中起到了關鍵的作用。

基因組數據庫通路富集分析發現主要涉及的通路有AGEs-RAGE信號通路、甲型流感通路、白介素-17信號通路等，涉及病毒、細菌、免疫調節、炎癥反應等多個方面。晚期糖基化終末產物受體信號通路可激活核因子-κB，使其進入細胞核，在核內同多種基因啟動子序列特異性結合，可引起大量黏附分子、生長因子、促炎細胞因子等的表達和釋放，引起慢性細胞活化和組織損傷[42]。白介素-17和腫瘤壞死因子信號通路都是參與炎癥反應和免疫調節的重要通路。由此推測黃芪—藿香—金銀花可能通過作用于上述通路，調節病毒相關通路，調控細胞凋亡和炎癥反應，從而達到預防新型冠狀病毒肺炎的效果。

綜上所述，黃芪—藿香—金銀花配伍其主要有效活性成分為槲皮素、山奈酚、木犀草素、尼泊爾鳶尾異黃酮和芒柄花黃素，可能通過作用于MAPK1、RELA、MAPK8、PRKCB、PRKCA等核心靶點，調控AGEs-RAGE信號通路、甲型流感通路、白介素-17信號通路等，從而預防新型冠狀病毒肺炎。網絡藥理學研究的局限性在于它不能得出任何藥效學的結論，其重要意義在于為尋找可能的有效活性成分、關鍵通路和作用靶點進行科學驗證。希望本研究為中醫藥防治新型冠狀病毒肺炎及中藥新藥的開發提供有益的思路。