左歸丸對磷酰胺氮芥體外誘導損傷顆粒細胞自噬與凋亡的影響

孫曉峰劉 濤曾貴榮陳勇超伍參榮喬 江

(1.湖南中醫藥大學醫學院組織學與胚胎學教研室,長沙 410208； 2.湖南中醫藥大學醫學院臨床醫學專業,長沙 410208； 3.湖南省藥物安全評價研究中心＆新藥藥效與安全性評價湖南省重點實驗室,長沙 410331；4.湖南中醫藥大學醫學院免疫學教研室,長沙 410208； 5.湖南中醫藥大學附屬第一醫院婦產科,長沙 410007)

卵巢早衰(Premature ovarian failure,POF)是指各種因素導致的女性卵巢儲備功能下降,由此引發提前絕經(40 歲之前)以及低雌激素、高促性腺激素癥狀。 近年來醫源性因素逐漸發展為POF 的重要因素[1-2],化療為其中之一,常見藥物有環磷酰胺(cyclophosphamide,CTX)、順鉑等。 化療所造成的POF 給女性患者帶來嚴重的生理問題和心理困擾[3]。 因此,如何恢復化療后女性卵巢功能,從而提高患者生存質量顯得尤為重要。 顆粒細胞圍繞在卵母細胞周圍,不僅為卵母細胞提供營養支持,而且對卵泡的發育和成熟起重要作用[4-5]。 大量研究證實：CTX 在體內被激活成具有活性的細胞毒性代謝物丙烯醛和PM,通過形成共價DNA 加合物造成DNA 結構破壞,從而阻斷DNA 復制,抑制細胞的增殖,甚至誘導其凋亡。 左歸丸是中醫婦科臨床治療POF 的常用方藥,臨床多以其為基本方加減。 本課題組前期藥效學研究的卵巢組織免疫組化檢測結果顯示：在體內動物實驗中,左歸丸降低了化療源性POF 小鼠顆粒細胞凋亡[6]。 自噬與凋亡能通過多種通路相互協調轉化,共同促進細胞死亡,而目前關于CTX 損傷顆粒細胞以及左歸丸保護顆粒細胞的機制中是否存在自噬過程的研究甚少。 本實驗以PM(CTX 的體外活性成分)建立化療源性體外顆粒細胞損傷模型,通過流式細胞術和Western blot 檢測各實驗組顆粒細胞凋亡率及自噬與凋亡相關蛋白如卵巢自噬啟動因子Beclin-1、微管結合蛋白輕鏈3(LC3BI/LC3BII)、自噬受體蛋白P62、凋亡蛋白Bax、Caspase3 的表達,進一步探討CTX 的活性成分——PM 建立體外誘導顆粒細胞損傷模型以及左歸丸含藥血清對顆粒細胞損傷的保護作用及相關機制,為進一步揭示此過程中是否存在自噬與凋亡的交叉對話關系奠定基礎,以期為臨床靶向治療提供參考。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

雌性SD 大鼠60 只,SPF 級,體重250 ～270 g,8周齡,購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司[SCXK(湘)2019-0004],在湖南省藥物安全評價研究中心＆ 新藥藥效與安全性評價湖南省重點實驗室SPF 級實驗室飼養[SYXK(湘)2015-0016]。 動物實驗經湖南省藥物安全評價研究中心倫理委員會批準(2019024),過程中遵循實驗動物學的3R原則。

1.1.2 實驗細胞

原代大鼠卵巢顆粒細胞,批號：iCell201910027,賽百慷上海生物技術股份有限公司產品。

1.2 主要試劑與儀器

左歸丸方劑由熟地、山藥、枸杞、山茱萸、川牛膝、菟絲子、鹿角膠、龜板膠組成,購自湖南中醫藥大學附屬一醫院,按照8 ∶4 ∶4 ∶3 ∶4 ∶4 ∶4 ∶4比例制成生藥1 g/mL 的中藥浸膏備用；PM(江蘇倍達醫藥科技有限公司合成,批號20180908)；電泳儀,北京六一公司產品；化學發光儀,博路騰公司產品；流式細胞儀,CytoFlex 公司產品；倒置顯微鏡,OLYMPUS IX71 產品；Annexin V-FITC/PI 雙染細胞凋亡檢測試劑盒,批號：640914,Biolegend 產品；BCA 蛋白定量試劑盒,批號：P0012S,碧云天產品；RIPA 蛋白裂解液,批號：P0013B,碧云天產品；二抗：Anti Rabbit IgG/HRP,批號：AS014Abclonal 公司產品。 一抗：兔抗P62,批號：A19700、兔抗BECLIN,批號：A7353、兔抗 CASP3, 批 號： A19654、 兔 抗 BAX, 批 號：A19684、兔抗LC3B,批號：A19665,均為Abclonal 公司產品；β-actin 內參,批號：AC026, Abclonal 公司產品。

1.3 實驗方法

1.3.1 造模與分組

將原代大鼠卵巢顆粒細胞接種于96 孔板中,待細胞生長至底壁的75%～80%時,將細胞分為4 組：①對照組(Control)；②模型組(M)；③左歸丸含藥血清組(10%ZGW)；④模型+左歸丸含藥血清組(M+10%ZGW)。 除對照組及左歸丸含藥血清組外,其余2 組每孔加入200 μL 終濃度為30 μmol/L 的PM進行處理,37℃,5%CO2細胞培養箱,培養24 h。

1.3.2 左歸丸含藥血清制備與給藥

SD 大鼠60 只隨機分為2 組：即正常血清組和ZG 血清組各30 只。 1 g/mL 的ZG 浸膏,根據成人與大鼠體表面積,換算成大鼠的用量,相當于臨床等效劑量的9 倍,即按照245.7 g/(kg?d),每天分兩次給ZG 血清組大鼠灌服,連續3 d,正常血清組給予等量純凈水,于末次灌胃后2 ～2.5 h 麻醉后腹主動脈采血,靜置30 min,離心后,無菌分離血清,-20℃保存,實驗前56℃30 min 滅活,0.22 μm 濾器過濾后使用。 PM 處理相應組24 h 后,Control 組及M 組加入10%正常大鼠血清；10%ZGW 組及M+10%ZGW 組加入10%左歸丸含藥血清,37℃,5%CO2細胞培養箱,培養24 h。

1.3.3 流式細胞術測定細胞凋亡情況

各組細胞離心收集,用4℃預冷PBS 洗滌2 次,然后用500 μL 結合緩沖液重懸細胞,調節其濃度為106/mL,取100 μL 細胞懸浮于5 mL 流式管中,加入5 μL Annexin V-APC 混勻后,再 加入5 μL Propidium Iodide 混勻,于室溫避光孵育15 min,隨后重懸于400 μL PBS,400 目篩網過濾,加樣于流式細胞儀(FACS)檢測細胞凋亡。 獲得細胞凋亡數據后用ModFitLT 軟件進行細胞凋亡相對定量分析。實驗重復3 次,結果取3 次平均值。

1.3.4 Western blot 檢測各組目標蛋白的表達

用胰酶消化好各組細胞后加入新鮮培養基,反復吹打使其脫壁并分散,制成細胞懸液,取各組適量細胞懸液置于已編號的EP 管內經1000 r/min 的速度離心5 min 后,棄去上清液,加入適量生理鹽水再次離心,棄去生理鹽水。 在EP 管內加入一定量RIPA 蛋白裂解液提取蛋白后,以14000 r/min 的速度離心10 min,取上清液。 按照相應的稀釋倍數將上樣緩沖液加入上清液中,在105℃環境中變性蛋白10 min,備用。 變性后的各組蛋白經SDS 凝膠電泳(1～2 h)、轉膜(60～80 min)、封閉(30 ～60 min)、孵一抗(4℃過夜)、洗膜(10 min×3 次)、孵二抗(60 min)、再次洗膜(10 min×3 次)等步驟后,使用ECL顯影液進行顯影,處理圖像,定性和定量分析各組條帶Beclin-1、LC3B、Bax 及P62 的表達。 實驗重復3 次,結果取3 次平均值。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 左歸丸含藥血清對顆粒細胞凋亡的影響

流式細胞儀檢測凋亡結果見表1、圖1。 可知：模型組較對照組顆粒細胞早期和晚期凋亡率上升,差異具有統計學意義。 而10%左歸丸含藥血清不僅能降低正常顆粒細胞的凋亡率,還可以降低PM誘發的卵巢顆粒細胞凋亡,且早期凋亡率有近4 倍差異,晚期凋亡率也有超過2 倍的差異,差異具有統計學意義。

2.2 左歸丸含藥血清對Bax、LC3B、Beclin-1、P62及Caspase3 蛋白表達的影響

如圖2、表2 所示,模型組較對照組Bax、LC3B、Beclin-1 及Caspase3 蛋白表達上升,P62 蛋白表達下降,差異具有統計學意義；而10%左歸丸含藥血清可降低正常和受損顆粒細胞Bax、LC3B、Beclin-1及Caspase3 蛋白表達,升高正常和受損顆粒細胞P62 蛋白表達,差異具有統計學意義。

表1 左歸丸含藥血清對顆粒細胞凋亡的影響(,n＝3)Table 1 Effect of serum containing Zuogui Pill on apoptosis of granule cells

表1 左歸丸含藥血清對顆粒細胞凋亡的影響(,n＝3)Table 1 Effect of serum containing Zuogui Pill on apoptosis of granule cells

注：與對照組比較,*P ＜0.05；與模型組比較,#P ＜0.05。Note.Compared with the control group, *P＜0.05.Compared with the model group, #P＜0.05.

分組Groups對照組Control左歸丸含藥血清組10%ZGW模型組M模型組+左歸丸含藥血清組M+10%ZGW早期凋亡率(%)Early apoptosis rate 3.21±0.29 1.43±0.07* 9.12±0.84* 2.41±0.13#晚期凋亡率(%)Late apoptosis rate 31.86±2.17 9.51±0.49* 48.92±0.65* 22.44±0.50#總凋亡率(%)Total apoptosis rate 35.07±2.19 10.95±0.56* 58.04±0.90* 24.85±0.47#

圖1 各組細胞周期分布Figure 1 cell cycle distribution of each group

圖2 左歸丸含藥血清對Bax、LC3B、Beclin-1、P62 及Caspase3 蛋白表達的影響Figure 2 Effects of serum containing Zuogui Pill on protein expression of Bax, LC3B, Beclin-1, P62 and Caspase3

表2 各組目標蛋白灰度分析數值統計( ,n＝3)Table 2 Gray level analysis value statistics of target protein in each group

表2 各組目標蛋白灰度分析數值統計( ,n＝3)Table 2 Gray level analysis value statistics of target protein in each group

注：與對照組比較,*P＜0.05；與模型組比較,# P ＜0.05。Note.Compared with the control group, *P ＜0.05.Compared with the model group, #P＜0.05.

分組Groups對照組Control左歸丸含藥血清組10%ZGW模型組M模型組+左歸丸含藥血清組M+10%ZGW P62/β-actin 1.13 ± 0.22 1.70 ± 0.29* 0.69 ± 0.05* 0.92 ± 0.06#BECLIN-1/β-actin 0.94 ± 0.11 0.60 ± 0.12* 1.83 ± 0.18* 1.30 ± 0.16#CASP3/β-actin 0.91 ± 0.07 0.46 ± 0.16* 1.98 ± 0.29* 1.09 ± 0.06#BAX/β-actin 1.06 ± 0.29 0.71 ± 0.14* 2.55 ± 0.72* 1.34 ± 0.53#LC3B/β-actin 0.97 ± 0.06 0.65 ± 0.08* 1.95 ± 0.24* 1.40 ± 0.21#

3 討論

隨著腫瘤發病的年輕化以及自身免疫性疾病發病率的升高,化療藥物的使用也隨之上升,由此對女性患者所帶來的POF 問題引起許多學者的關注。 化療藥物對卵巢的影響主要與其對顆粒細胞和卵母細胞的損害有關,且呈劑量依賴性[7]。 CTX是基礎的化療藥物,其可影響卵巢血供[8]、誘導顆粒細胞凋亡[9]以及形成卵巢氧化應激損傷[10],大多數研究集中在CTX 誘導顆粒細胞凋亡這一機制上。

細胞自噬和凋亡被認為是代表細胞死亡機制的連續部分：自噬為凋亡所必需,自噬先于凋亡,進而促進凋亡；或自噬抑制凋亡；或者自噬與凋亡共同促進細胞死亡,抑制其中之一都會轉變為另一種細胞死亡途徑。 自噬作為真核細胞內廣泛存在的降解和再循環系統,在廢物清除、結構重建、細胞生長發育、蛋白代謝平衡維持和細胞內環境穩定中起重要作用[11]。 Beclin-1 是自噬啟動關鍵因子；LC3B是自噬體的標記蛋白,新合成的LC3B 蛋白經加工后成為LC3B-I,位于細胞質中,隨后LC3B-I 與磷脂酰乙醇胺連接,通過泛素化樣酶促反應成為LC3BII,與自噬體的內膜和外膜均結合,自噬體內膜的LC3B-II 在自噬溶酶體中被降解而進入再循環,LC3B 的合成、LC3B-I 到LC3B-II 的轉化率是檢測自噬的通用指標；自噬底物的降解通過標記細胞內部受體蛋白P62 的降解來佐證自噬的完成,P62 蛋白水平高低與自噬活性成反比,其增加提示自噬/溶酶體降解途徑被抑制,其表達量變化可用于監測自噬流[12]。 研究發現自噬與凋亡存在著分子聯系,在死亡受體和線粒體介導的細胞凋亡通路中,自噬的調控蛋白Beclin1 是Caspase-3、-7、-8 的剪切對象[13],而Bax 屬于Bcl-2 家族成員之一,可作為Caspase-3 的上游調控蛋白,啟動Caspase 級聯反應[14]。 目前尚未有研究揭示PM 損傷顆粒細胞的機制中是否同時存在自噬與凋亡現象? 二者是否存在交叉對話?

中醫臨床上治療POF 時針對不同病因并無特定的治療方法,而是從辯證論治出發,以補腎填精為主、活血理氣為輔,左歸丸是補腎填精的主要方劑。 課題組前期研究及其他相關研究證實：以CTX為代表的一些化療藥物可通過上調Bax 蛋白的表達、下調Bcl-2 蛋白的表達、促進卵巢顆粒細胞凋亡從而造成卵巢損傷。 而左歸丸可降低化療源性POF 小鼠顆粒細胞凋亡率,保護卵巢功能[6,15-16]。本實驗建立PM 體外誘導原代卵巢顆粒細胞損傷模型,使用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率并通過蛋白表達角度觀察顆粒細胞中自噬相關蛋白如Beclin-1、 LC3BI/LC3BII 及 凋 亡 相 關 蛋 白 Bax、Caspase3 的表達情況。 結果顯示：①模型組顆粒細胞凋亡率較對照組而言顯著升高,10%左歸丸含藥血清可降低顆粒細胞凋亡率；②自噬相關蛋白如Beclin-1、 LC3BI/LC3BII 及 凋 亡 相 關 蛋 白 Bax、Caspase3 在PM 作用的顆粒細胞中,相對于對照組而言有高表達,10%左歸丸含藥血清可下調上述蛋白在模型組中的表達；然而受體蛋白P62 的表達較對照組降低,10%左歸丸含藥血清可上調模型組P62 蛋白的表達。 以上結果說明PM 可通過促進凋亡、激活自噬/溶酶體降解途徑的機制損傷顆粒細胞；10%左歸丸含藥血清能緩解由此帶來的損傷,同時影響了顆粒細胞自噬和凋亡過程,二者同時存在,且可能存在交叉對話。

綜上所述,PM 促進了顆粒細胞的凋亡過程,與自噬相關,二者可能存在交叉對話。 左歸丸含藥血清抑制了化療損傷源性卵巢顆粒細胞凋亡,降低此過程中自噬與凋亡的活性,為下一步深入探討自噬與凋亡間交叉對話點奠定了實驗基礎,同時為左歸丸的藥效學研究提供了新的理論及實驗基礎,也為POF 的防治提供新理論。 如能選擇性地抑制卵巢細胞的自噬與凋亡過程,保護卵巢逃避化療藥物的作用或化療后幫助恢復卵巢功能,則能極大地造福于化療后POF 患者,對于臨床具有重要意義。