PDX 模型在胃癌研究方面的應用與挑戰

李雨真金春暉

(南京中醫藥大學附屬無錫醫院,腫瘤科,江蘇 無錫 214071)

在我國,胃癌(gastric cancer,GC)發病率隨著人口老齡化的越來越嚴重將成上升趨勢,而它又是死亡率較高的惡性腫瘤[1-2]。 現如今,缺乏有效的抗腫瘤藥物是關鍵因素,故臨床前研究至關重要,動物模型與其密切相關[3]。

現代研究表明,癌癥是一種高度異質性疾病,是由細胞中基因組、表觀基因和轉錄組改變的結合引起,即使源于同一器官的腫瘤也存在著很大的差異性,所以腫瘤的精準治療尤為重要[4]。 精準腫瘤學是一種癌癥治療的策略,使用癌癥的分子譜分析來對患者進行分層,尋找到疾病的原因和治療的靶點,最終實現對于疾病和特定患者進行個性化精準治療的目的[5]。

傳統的細胞系腫瘤模型(cell line-derived xenograft,CDX)是將人體腫瘤細胞體外培養、傳代,建立穩定的細胞系后再注入免疫缺陷小鼠體內,然而該模型不能很好地保留原腫瘤的生物學特性[6],故實驗數據缺乏真實性與可靠性,無法提供腫瘤的精準化治療策略。 于是,人源性異種移植模型(patient-derived xenograft model,PDX)應運而生,它與病人原始腫瘤的生物特征有很高的一致性的,比如,方天等[7]建立的肺癌PDX 模型與患者原代腫瘤有相同的組織學特點和排列結構,驗證了在組織與基因水平上,PDXs 的患者腫瘤中有相當程度的腫瘤特征可以被保留；再者,有研究表明在人群水平上,PDXs 與人類癌癥的基因組圖譜非常相似,更廣泛地代表了患者間的多樣性[8-9]。 總之,它彌補了傳統細胞系模型的不足,為腫瘤研究提供了新的平臺選擇。 本文總結了胃癌PDX 模型的建立方法,歸納了近幾年來的研究應用,提出了建立胃癌PDX 模型的挑戰,現綜述如下。

1 胃癌PDX 模型的建立方法

建立一個完整的PDX 模型主要取決于三個關鍵要素它們分別是移植樣本,工具小鼠以及移植部位的選擇。

1.1 移植樣本的獲取及保存

本文主要討論的是胃癌PDX 模型的建立,所以移植樣本自然是患者來源的胃腫瘤組織,可以在手術過程中獲得,也可以直接在胃鏡下活檢取得。 通常,從切除到植入的最佳時限是30 min～1 h[10]。 手術和活檢樣本應立即放入預先裝有冷無菌培養基的收集管中,或者鹽水(0.9%氯化鈉)和標準組織培養基(例如RPMI 或DMEM)都是可以短期保存樣本的培養基。 但是,如果無法在最佳時限內植入樣本,則應將其保存在已證明可長時間支持細胞生存能力的培養基中。 有研究表明,HypothermosolTM有助于維護腫瘤細胞活力長達48 h[11]。 值得一提的是,在采集樣本及處理樣本時,必須嚴格執行無菌操作,以防止污染,降低植入的失敗率。

1.2 工具小鼠的選擇

大量實驗研究表明,具有免疫缺陷的小鼠更易接收樣本,然而市面上有四種免疫缺陷小鼠系,它們分別是裸鼠(nude mice)、重度聯合免疫缺陷小鼠(severe combined immunodefi-ciency mice, SCID)、非肥胖糖尿病/重度聯合免疫缺陷小鼠(non-obese diabeticmice/Severe combined immune deficiency mice, NOD/SCID)以及NOG 小鼠。 有研究者開發了一種通過腫瘤植入指數(tumor engraftment index,TEI)定量評估各種小鼠免疫缺陷的方法,用于幫助實驗者們選擇合適的研究模型,其中,NOD-scid-IL2Rg-/-(NSG)的TEl 得分最高,即免疫缺陷程度最大,適合作為多種人源腫瘤組織的移植宿主[12],而NOD.Cg-Prkdc-scidIL2rgtm1Sug/JicCr1(NOG)小鼠的異種移植成功率高、生存時間長等特點也是異種移植良好的模型[13]。

1.3 移植部位和方式的選擇

距離成功的最后一步便是選擇恰當的移植方式,較常見的有皮下移植、腎包膜移植以及原位移植。 皮下移植操作簡便,且易于觀察和檢測移植瘤的大小,但移植失敗率較高,也無法適用于腫瘤轉移的研究；腎包膜移植操作難度較大但成瘤率較高,現有研究表明七甲川菁染料(heptamethine cyanine dyes)具有腫瘤成像和靶分子的雙重功能,已經可以用于篩選多個不同類型的移植于腎包膜內的PDX 模型,包括胃癌、肝細胞癌(hepatocellular,HCC)和腎癌(renal carcinoma, RCC)等[14]。 原位移植因其容易發生轉移的特性,所以常常用于建立胃癌轉移模型。 王潔等[15]利用臨床腫瘤標本成功建立胃癌轉移模型并驗證了移植瘤組織結構與患者基本保持一致。

2 胃癌PDX 模型的研究應用

2.1 個體化治療

胃癌PDX 模型已被證實其腫瘤在病理學特點、遺傳表征及對藥物反應方面均與原發瘤保持高度一致[16],于是,“小鼠替身”的概念便被引入,它們代替病人去測試不同藥物方案的治療效果,從中篩選出最有效的治療方案,大大減少了患者因無效治療而損失的時間及經濟成本。 眾所周知,曲妥珠單抗在改善HER-2 陽性胃癌患者的治療效果中發揮了重要作用。 但是,一旦疾病進展,就缺乏二線治療的證據。 受此啟發,Aguilar-Mahecha 等[17]將一例HER-2 陽性胃癌伴有肺肝轉移的患者進行“阿凡達”試驗,以測試T-DM1 能否作為該患者的二線治療藥物。 其中治療決策由PDX 數據指導,并用連續血液標本ctDNA 標記監測治療反應。 研究結果表明,在治療選擇有限的患者中,使用PDX 模型識別個性化有效療法是十分可行的,并且ctDNA 的水平是反應和疾病進展的敏感預測指標,并且優于CEA測試。

2.2 潛在靶點的驗證與靶向藥物的研究

到目前為止,適用于胃癌患者的靶向治療藥物品種并不多,所以,潛在靶點的探索和新型靶向藥物的研究至關重要。 近幾年來,PDX 模型為潛在靶點方面做出了不少的貢獻。 例如,Wang 等[18]建立了9 個PDX 模型,驗證了一些關鍵分子如EGFR、HER-3、MET 和PDL-1,并在其中的一個PDX 模型中發現攜帶c-Met 或FGFR-2 基因擴增的大部分胃癌患者可以受益于c-Met 或FGFR-2 靶向治療或聯合靶向治療。 Zhu 等[19]研究發現了抗CLDN18.2 ADC 和抗CLDN18.2 CD3 雙特異性分子對已建立的胃和胰腺腺癌患者來源的腫瘤具有療效,證實了CLDN18.2 是治療胃和胰腺腺癌的潛在藥物靶標。Seo 等[20]首次報告GPR177 在胃癌患者中高表達,建立胃癌PDX 模型表明GPR177 可作為預后標志物的新型候選藥物,也是胃癌患者有治療希望的靶標。 Zhang 等[21]通過PDX 模型驗證了環狀RNA circNRIP1 的腫瘤促進劑作用,發現circNRIP1 抑制劑可通過AKT1/mTOR 信號傳導途徑阻斷胃癌細胞的惡性行為,為circNRIP1 抑制劑用于胃癌治療提供了依據。 Corso 等[22]建立了一個包括100 位患者來源的異種移植、原代細胞系和細胞質的廣泛、多層次的胃癌模型平臺。 根據組織學、微衛星穩定性、Epstein-Barr 病毒(EBV)狀態和分子結構對樣本進行分類,從中鑒定了micro satellite instability(MSI)信號通路,并有助于進展期胃癌的精準治療。

與此同時,一些新的生物標志物也在PDX 模型中得到驗證。 例如,Li 等[23]發現患者血漿cfDNA中羥甲基胞嘧啶(5-Hydroxymethylcytosine 5hmC)水平升高的基因富含PDX 模型血漿cfDNA 中5hmC水平較高的基因,驗證了癌癥患者血漿cfDNA 與原發腫瘤的相關性,表明循環cfDNA 的5hmC 生物標志物對結直腸癌和胃癌的預測能力很強,優于傳統生物標志物。 近期的一項研究建立胃癌PDX 模型驗證了TfR1 是胃癌的潛在識別生物標志物,并發現負載阿霉素的HFn 納米載體(doxorubicin HFn nanocarrier, HFn-Dox)對GC-PDX 腫瘤具有優異的抗腫瘤作用,為疾病的診斷和治療提供了新的方法[24]。

PDX 模型在靶向藥物研究方面也發揮了自身的價值,例如,Chen 等[25]采用分子譜清晰的5 株人GC 細胞系和8 個患者源性異種移植瘤(PDX)模型評價阿法替尼的抗腫瘤活性和機制,發現阿法替尼對EGFR/HER2 高擴增(拷貝數26) 或過表達(HC34)的PDX 模型具有很強的抗腫瘤作用,為未來的臨床開發阿法替尼作為單一療法或聯合治療胃癌提供了強有力的證據。

2.3 人-鼠共臨床試驗

“共同臨床試驗”結合了PDX 模型臨床前實驗和患者Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗的一種研究,旨在開發個性化抗癌治療的精密醫學[26]。 一項奧拉帕利(olaparib)和替莫唑胺(temozolomide)聯合治療方案在復發性小細胞肺癌(small-cell lung cancer,SCLC)患者中的I/II 期研究以及在患者源性異種移植物(PDXs)中進行生物標志物發現的聯合臨床試驗研究中發現此方案在來自4 名患者的PDX 模型中的療效與在現實中看到的情況相同,并且在PDX 模型中對“OT”的敏感性和耐藥性的候選生物標志物,也在患者樣品中得到了驗證[27]。 然而遺憾的是,關于胃癌的相關研究寥寥無幾,可能與現在胃癌PDX 庫的PDX 數量較少有關,所以,胃癌PDX 模型還有很大的前景,等待更多的研究者們去探索和挖掘。

3 建立胃癌PDX 模型的挑戰

3.1 淋巴瘤的轉化

與其他腫瘤PDX 模型不同的是,胃癌PDX 模型有著較高的淋巴瘤(lymph-gland, LT)發生率[28]。對于形成這些LT 的原因,不同的人有著不同的觀點,一些人認為是來源于患者的腫瘤浸潤淋巴細胞的被激活和過度生長[29]。 一些人認為,在人體內處于潛伏狀態的EBV 感染的B 細胞,在被移植到缺乏功能性免疫細胞的小鼠后,活化形成了淋巴瘤[22]。還有一些人認為,慢性炎癥引起淋巴細胞浸潤增加,而胃癌病例中的基底炎癥發生率高,于是增加了胃癌PDX LT 的形成率[28-31]。 目前,有研究表明,常規利妥昔單抗給藥對減少肝內膽管癌(intrahepatic cholangiocarcinoma, ICC)和肝細胞癌PDX 模型中淋巴瘤的產生效果顯著,但尚無有效的方法來預防EBV 相關的B 細胞淋巴瘤[32]。

3.2 建模時間長

腫瘤異種移植通常需要漫長的4 ～8 個月的等待,還需要產生足夠的組織來試驗藥物療效。 而晚期患者并沒有足夠的時間也沒有足夠的金錢,所以,縮短建模時間以及加快藥物敏感性測試顯得尤為重要。 對于前者,有學者提出以斑馬魚胚胎作為受體構建胃癌PDX 模型可相對節約時間成本[33]；對于后者,有研究者開發了一種miniPDX 模型,將患者來源的腫瘤細胞注入中空纖維膠囊內,快速有效地檢測藥物敏感性的方法[34]。 此方法在一例Mini-PDX 模型結合DNA-WES/RNA 分析指導轉移性十二指腸腺癌患者個體化治療的研究中得到驗證[35]。

3.3 傳代不穩定性

在連續傳代過程中,人類基質逐漸被小鼠基質而取代,導致腫瘤的特殊調節機制以及諸如間質液壓力等物理特性的改變,從而擾亂腫瘤微環境,使得相關藥物的研究存在較大的誤差[36]。 一項針對24 種癌癥的1110 個PDX 樣本的研究發現,在PDX傳代期間獲得的拷貝數改變(copy number alteration, CNA)與患者腫瘤進展期間獲得的拷貝數改變有所不同,于是基因組改變是否會對模型產生負面影響的問題也隨之而來[37]。

3.4 無法評估免疫療法

如前所述,建立PDX 模型的關鍵之一是使用免疫缺陷宿主菌株進行腫瘤植入和繁殖。 因此無法準確評估免疫療法,例如疫苗和免疫調節劑以及激活抗腫瘤免疫系統的藥物療效[38]。 Lin 等[39]將人類CD34 + HSPC 或PBMC 移植到CDX 或PDX 小鼠模型中,成功建立了PBMCs-CDXs,PBMCs-PDX和auto-PBMCs-PDX 人源化免疫重建小鼠系統模型,為藥物開發,評估免疫療法以及指導臨床決策提供有希望的平臺。

3.5 保存困難，耗費較大

為了PDX 模型后續再移植效率的提高,實驗室需要有長期的低溫有效冷凍保存的條件。 并且,以該類模型為基礎的腫瘤精準醫學研究需要研究者投入大量的人力物力財力。 目前,全球已建成的PDX 庫包括美國國家癌癥研究所(NCI)的患者模型存儲庫、異種移植公共存儲庫(PRoXe)、歐洲EuroPDX 資源等大規模PDX 模型平臺[40],都是國家級多機構平臺通過一系列復雜而困難的程序以確保實驗方案的實施。 而人源性類器官(patientderived organoids, PDOs)是經過體外三維培養構建的多細胞團,不僅能夠無限增值,還可以通過基因改造技術,實現疾病模型的建立,相對PDX 模型來說可以節省大量的時間與資源[41-42]。

4 總結

現如今,癌癥的研究朝著精準醫學發展,強調個體化治療,但是在個性之中也別忽視了共性。 目前已有多個胃癌PDX 模型庫,涵蓋了常見的病理類型、甲胎蛋白AFP 分泌型及HER2 陽性型[43],為精準醫學提供了良好的研究平臺,但是,庫中模型數量還遠遠達不到臨床試驗的需求,因此,更大樣本量的胃癌PDX 庫的建立需要后繼者們共同來完成。與此同時,胃類器官及胃癌類器官與PDX 互相補充,聯合使用,進一步完善了腫瘤體外及體內的研究設計。 相信在不久的將來,治療手段的豐富應用,抗胃癌藥物的大量研發會使胃癌病人對疾病不再恐懼。