痰喘寧合劑平喘、鎮咳、祛痰作用研究

董琳琳閆慧敏豐晨然石 璐苗 豐趙一穎陳 芳孫文燕*郝 靜*

(1.北京中醫藥大學中藥學院中藥藥理系,北京 102488；2.國家兒童醫學中心 首都醫科大學附屬北京兒童醫院中醫科,北京 100045)

咳嗽是兒童常見多發病,多伴有咳痰、喘息等表現,往往反復發作,難以根治。 該病病理表現多以慢性氣道炎癥、氣道高阻力為主,易受吸煙及環境中的過敏原或生活污染物影響[1]。 痰濕蘊肺型咳嗽在臨床中較為常見,中醫理論認為其主要病因是陰虛肺熱,脾腎虧虛[2]。 痰喘寧合劑為北京兒童醫院的院內制劑,用于痰濕蘊肺型患兒有確切臨床療效[3],而對其藥效尚缺乏系統研究。 本研究分別采用卵蛋白所致過敏性哮喘大鼠模型、氯化乙酰甲膽堿及磷酸組胺引喘豚鼠模型、氨水引咳小鼠模型、枸櫞酸引咳豚鼠模型、小鼠氣管段酚紅排泌量實驗,觀察痰喘寧合劑的平喘、鎮咳、祛痰作用,以期為其臨床合理應用提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF 級SD 大鼠5 周齡(體重130 ～150 g)84只,SPF 級ICR 小鼠4 周齡(體重14 ～16 g)144 只,均雌雄各半,購自北京維通利華實驗動物技術有限公司[SCXK(京)2016-0006]。 SPF 級豚鼠4 周齡132 只,體重200～230 g,雌雄各半,購自于北京科宇動物養殖中心[SCXK(京)2018-0010]。 實驗前適應性飼養7 d,實驗期間,保持動物房室溫在(21±5)℃,相對濕度為40%～70%,光照條件設置為12 h/12 h 明暗交替。 實驗大鼠自由進食,自由飲水。所有涉及動物的相關實驗程序均已經過北京中醫藥大學學術委員會實驗動物倫理小組委員會批準(bucm-4-20190611-2045),大鼠、小鼠飼養于北京中醫藥大學SPF 級動物實驗室[SYXK(京)2016-0038],豚鼠飼養于中國中醫科學院中藥安全評價實驗室[SYXK(京)2016-0013],并經過中國中醫科學院中藥研究所動物實驗福利倫理審查通過(20193004)。 實驗過程中所有操作均符合3R原則。

1.2 主要試劑與儀器

痰喘寧合劑(北京兒童醫院)；卵蛋白(Sigma,批號：SLBV7493)；注射用氫氧化鋁凝膠(Pierce,批號： SH255260)； 磷 酸 組 胺, 氯 化 乙 酰 甲 膽 堿(Bioruler,批號分別為：3410,r621712)；醋酸地塞米松(天津力生制藥股份有限公司,批號：20170401)；氨溴特羅(北京韓美藥品有限公司, 批號：H20040317)；小青龍合劑(西安天一秦昆制藥有限責任公司,批號：180306)； 10%中性緩沖福爾馬林固定液,Harris 蘇木素,0.5%伊紅,中性樹膠封片劑(北京益利精細化學品有限公司)；Rat IgE、IL-4、IL-17、TNF-α ELISA 試劑盒(瑞格博,批號分別為：20200129.60139R、 20200129.60021R、 20200129.60032R、20200129.60080R)；瑞氏吉姆薩染色液(南京建成)；枸櫞酸,酚紅(Salarbio,批號分別為：126E041,1211C031)；氨水(北京化工廠,批號：20141008)。

402A、B 型超聲霧化器(江蘇魚躍醫療設備有限公司)；Buxco 實驗動物氣道阻力和肺順應性有創檢測儀器(美國Buxco 公司)； 移液器(美國Eppendoff 公司)；臺式離心機,低溫水平高速離心機(美國Thermo Scientific 公司)；Tissue-TEK VIP6 生物組織脫水儀、Tissue-TEK TEC 生物組織包埋儀(日本櫻花公司)；Leica RM2235 組織切片儀、Leica HI1210 撈片機、Leica HI1220 烤片機、Leica ST5020自動染色儀、Leica CV5030 自動封片機(德國萊卡公司)；Olympus BX53 顯微鏡(美國奧林帕斯公司)Path QC 病理質控和資料管理系統(中國朗珈公司)；酶標儀(美國Epoch, BioTek 公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 痰喘寧合劑平喘作用研究

(1)卵蛋白(OVA)所致哮喘大鼠實驗

將SD 大鼠隨機分為7 組[4]：正常組、模型組、痰喘寧合劑低劑量組(7.5 mL/kg)、痰喘寧合劑中劑量組(15 mL/kg)、痰喘寧合劑高劑量組(30 mL/kg)、醋酸地塞米松組(0.55 mg/kg),小青龍合劑組(4 mL/kg)。 每組12 只,雌雄各半。 除正常組外,其余動物建立哮喘大鼠模型：于實驗第1 日、第8 日在大鼠的腹腔、兩腹股溝注射每mL 含10 mg OVA、100 mg AL(OH)3的混懸液,注射劑量為(腹腔0.5 mL,兩腹股溝各0.25 mL),正常組注射相同體積的生理鹽水。 實驗第15 天,各組按劑量灌胃,正常組及模型組給予生理鹽水。 模型組和各給藥組在給生理鹽水或相應藥物1 h 后用1% OVA 霧化激發30 min,正常組則用生理鹽水代替,連續7 d。 于末次激發24 h 后,大鼠麻醉,仰面固定,氣管插管,置于密閉體描箱內,肺功能儀系統輔助呼吸。 等待大鼠氣道阻力基線穩定,滴加不同濃度的氯化乙酰甲膽堿20 μL(0、6.25、12.5 和50 mg/mL),霧化30 s,記錄3 min,檢測氣道阻力(RL)。 將大鼠從密閉體描箱取出,腹主動脈取血,室溫靜置2 h 后,4℃,3000 r/min離心10 min,ELISA 法檢測血清中IgE、IL-4、IL-17和TNF-α 的含量。 分別將2 mL、2 mL、1mL 生理鹽水于氣管插管處緩慢注入,停留約10 s 后,緩慢抽回, 收集灌洗液( bronchoalveolar lavage fluid,BALF),4℃,1500 r/min 離心10 min,取沉淀用0.2 mL PBS 混懸,瑞氏染色,用于WBC 及EOS 計數。取出大鼠右肺下葉組織,將其置于10%福爾馬林固定液中,進行常規石蠟包埋并切片,HE 染色,光學顯微鏡下觀察右肺下葉組織病理變化,并進行支氣管及周圍炎癥評分。 根據其病變的嚴重程度半定量為：無病變,記0 級,為0 分；輕度,記Ⅰ級,為1分；中度,記II 級,為2 分。

HE 染色步驟如下：二甲苯溶液I、II 浸泡各15 min 脫蠟；100%乙醇溶液I、II 浸泡5 min；95%、85%、75%梯度乙醇溶液浸泡,各5 min；蘇木素染液染色5 min,水洗；鹽酸乙醇溶液分化2 ～3 s,水洗；氨水溶液浸泡返藍1 min,水洗；伊紅染液染色5 min；75%、85%、95%梯度乙醇溶液浸泡,各5 min；100%乙醇溶液I、II 浸泡,各5 min；二甲苯溶液I、II浸泡,各5 min；中性樹膠封片。

(2)氯化乙酰甲膽堿及磷酸組胺引喘豚鼠實驗

將豚鼠置于霧化器內[5],以2%氯化乙酰甲膽堿與0.1%磷酸組胺等體積混合液定量恒壓噴霧10 s,記錄2 min 內豚鼠從接受噴霧開始到出現喘息性抽搐,直至跌倒的潛伏期。 引喘潛伏期超過120 s者舍棄不用。 將篩選出的豚鼠隨機分為模型組、痰喘寧合劑低劑量組(8.4 mL/kg)、痰喘寧合劑中劑量組(16.8 mL/kg)、痰喘寧合劑高劑量組(33.6 mL/kg)、氨溴特羅組(4.5 mL/kg)、小青龍合劑組(4.5 mL/kg),每組10 只,雌雄各半。 各組按劑量灌胃,模型組灌胃等量生理鹽水,連續7 d。 末次給藥1 h 后,用上述方法測定各組豚鼠引喘潛伏期。

1.3.2 痰喘寧合劑鎮咳作用研究

(1)枸櫞酸引咳豚鼠實驗

將豚鼠置于霧化器內[6],以17.5%的枸櫞酸霧化1 min,并持續刺激4 min,測定5 min 內豚鼠的咳嗽次數,小于10 次者舍去。 將篩選合格的豚鼠隨機分為模型組、痰喘寧合劑低劑量組(8.4 mL/kg)、痰喘寧合劑中劑量組(16.8 mL/kg)、痰喘寧合劑高劑量組(33.6 mL/kg)、氨溴特羅組(4.5 mL/kg)、小青龍合劑組(4.5 mL/kg),每組10 只,雌雄各半。 各組按劑量灌胃,模型組灌胃等量生理鹽水,連續3 d。末次給藥1 h 后,用上述方法測定各組豚鼠咳嗽潛伏期及咳嗽次數。

(2)氨水引咳小鼠實驗

將小鼠隨機分為模型組、痰喘寧合劑低劑量組(5.72 mL/kg)、痰喘寧合劑中劑量組(11.43 mL/kg)、痰喘寧合劑高劑量組(22.85 mL/kg)、氨溴特羅組(5.70 mL/kg)、小青龍合劑組(6.50 mL/kg),每組12 只,雌雄各半。 各組小鼠按劑量灌胃,模型組灌胃等量的生理鹽水,連續3 d。 末次給藥1 h后,將小鼠置于倒置的500 mL 燒杯中,放入注有0.2 mL 氨水的棉球。 1 min 后將棉球取出,觀察2 min。 小鼠第一次咳嗽(小鼠張大嘴,同時腹部收縮,偶有咳嗽聲)時間即為咳嗽潛伏期,并記錄3 min 內咳嗽次數。

1.3.3 痰喘寧合劑祛痰作用研究

將小鼠隨機分為模型組[6]、痰喘寧合劑低劑量組(5.72 mL/kg)、痰喘寧合劑中劑量組(11.43 mL/kg)、痰喘寧合劑高劑量組(22.85 mL/kg)、氨溴特羅組(5.70 mL/kg)、小青龍合劑組(6.50 mL/kg),每組12 只,雌雄各半。 各組小鼠按劑量灌胃,模型組灌胃等量的生理鹽水,連續3 d。 末次給藥30 min后,腹腔注射2.5%的酚紅溶液(0.2 mL/10 g)。 30 min 后處死,剪開頸部,暴露氣管,剪下自甲狀軟骨至氣管分叉處的一段氣管,放入2 mL 碳酸氫鈉與生理鹽水的混合液中(比例為1 ∶15),酶標儀檢測546 nm 處的吸光度(OD)值,利用標準曲線計算酚紅排泌量。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 痰喘寧合劑平喘作用研究

2.1.1 痰喘寧合劑對OVA 所致哮喘大鼠氣道阻力的影響

相較于正常組,模型組大鼠RL在乙酰甲膽堿濃度為0、12.5、50 mg/mL 時均升高(P＜0.05)。 相較于模型組,痰喘寧合劑低劑量組與小青龍合劑組在乙酰甲膽堿濃度為0、12.5、50 mg/mL 時RL降低(P＜0.05 或P＜0.01)；痰喘寧合劑中劑量組在乙酰甲膽堿濃度為6.25 mg/mL 時,相對于模型組,RL有所升高(P＜0.05)；醋酸地塞米松組在乙酰甲膽堿濃度為50 mg/mL 時,RL降低(P＜0.05)。 結果見表1。

2.1.2 痰喘寧合劑對OVA 所致哮喘大鼠血清IgE、IL-4、IL-17 和TNF-α 水平的影響

相較于正常組,模型組大鼠血清中IgE、IL-4、IL-17 和TNF-α 水平升高(P＜0.01)；相較于模型組,醋酸地塞米松組IgE 水平降低,痰喘寧合劑各劑量組IgE 水平均有降低趨勢(P＞0.05)；相較于模型組,痰喘寧合劑中劑量組及醋酸地塞米松組IL-4、IL-17 及TNF-α 水平降低(P＜0.05 或P＜0.01)；小青龍合劑組IL-17 水平降低(P＜0.01)。 結果見表2。

2.1.3 痰喘寧合劑對OVA 所致哮喘大鼠肺泡灌洗液WBC 及EOS 的影響

相較于正常組,模型組大鼠BALF 中WBC 數量和EOS 百分比升高(P＜0.01)。 相較于模型組,痰喘寧合劑各劑量組、醋酸地塞米松組及小青龍合劑組均可降低BALF 中WBC 數量和EOS 百分比(P＜0.01)。 結果見表3。

2.1.4 痰喘寧合劑對OVA 所致哮喘大鼠肺組織病理影響

正常組大鼠支氣管管腔未見擴張,管腔內無分泌物,皺襞如常,上皮細胞未見變性、壞死及脫落,平滑肌層未見增生,管壁未見增厚；周圍血管未見增生及擴張,間質及肺泡腔未見明顯炎癥。 模型組大鼠支氣管管腔局部見代償性擴張,管腔內見分泌物,皺襞或增生或平坦,上皮細胞變性,局部可見脫落,管壁增厚,平滑肌層增生明顯；周圍血管增生、擴張,間質及肺泡腔見中等量炎癥,肺組織炎癥評分升高(與正常組相比,P＜0.01)。 痰喘寧合劑低劑量組支氣管管腔輕度擴張,管腔內罕見分泌物,皺襞較為平坦,上皮細胞輕度變性,未見壞死及脫落,管壁輕度增厚,平滑肌層增生較少量；周圍血管增生、擴張,間質及肺泡腔見中等量炎癥,肺組織炎癥評分有降低趨勢(與模型組相比,P＞0.05)。 痰喘寧合劑中劑量組支氣管管腔輕度擴張,支氣管管腔內未見分泌物,皺襞較為明顯,上皮細胞變性不明顯,未見壞死及脫落,管壁輕度增厚,平滑肌層增生不明顯；周圍少量血管增生、擴張,間質及肺泡腔見少量炎癥,肺組織炎癥評分降低(與模型組相比,P＜0.05)。 痰喘寧合劑高劑量組支氣管管壁輕度擴張,管腔內未見分泌物,皺襞較為明顯,上皮細胞變性不明顯,未見壞死及脫落,管壁增厚及平滑肌層增生均不明顯；周圍極少量血管增生、擴張,間質及肺泡腔見少量炎癥,肺組織炎癥評分降低(與模型組相比,P＜0.01)。 醋酸地塞米松組支氣管管腔擴張不明顯,管腔內可見分泌物,皺襞代償性增生,上皮細胞輕度變性,未見壞死及脫落,支氣管管壁輕度增厚,平滑肌層增生不明顯；周圍血管增生、擴張,間質及肺泡腔見中等量炎癥,肺組織炎癥評分降低(與模型組相比,P＜0.05)。 小青龍合劑組支氣管管腔擴張不明顯,支氣管管腔內偶見分泌物,皺襞代償性增生,管腔上皮細胞輕度變性,未見壞死及脫落,管壁輕度增厚,平滑肌層增生不明顯；周圍血管增生、擴張,間質及肺泡腔見中等量炎癥(與模型組相比,P＞0.05)。 結果見表4 及圖1。

表1 痰喘寧合劑對OVA 所致哮喘大鼠RL 的影響( , cmH2O/(mL/s), n＝12)Table 1 Effects of Tanchuanning Mixture on airway resistance in asthmatic rats induced by OVA

表1 痰喘寧合劑對OVA 所致哮喘大鼠RL 的影響( , cmH2O/(mL/s), n＝12)Table 1 Effects of Tanchuanning Mixture on airway resistance in asthmatic rats induced by OVA

注：與正常組相比,aP ＜0.05；與模型組相比,cP ＜0.05, dP ＜0.01。Note.Compared with the normal group, aP ＜0.05.Compared with the model group, cP ＜0.05, dP ＜0.01.

Mch(mg/mL) 劑量(mL/kg)Dose 0 6.25 12.5 50正常組Normal group - 0.34±0.09 0.46±0.11 0.51±0.07 0.60±0.13模型組Model group - 0.45±0.12a 0.50±0.21 0.72±0.30a 1.01±0.47a醋酸地塞米松組Dexamethasone acetate group 0.55(mg/kg) 0.44±0.30 0.59±0.29 0.66±0.21 0.71±0.23c小青龍合劑組Xiaoqinglong Mixture group 4.00 0.32±0.08c 0.38±0.09 0.50±0.15c 0.49±0.16d痰喘寧合劑低劑量組Tanchuanning Mixture low dosage group 7.50 0.31±0.11d 0.46±0.12 0.46±0.14d 0.61±0.26c痰喘寧合劑中劑量組Tanchuanning Mixture moderate dosage group 15.00 0.37±0.10 0.58±0.13c 0.66±0.10 0.77±0.25痰喘寧合劑高劑量組Tanchuanning Mixture high dosage group 30.00 0.39±0.08 0.52±0.16 0.64±0.31 0.74±0.31

2.1.5 痰喘寧合劑對氯化乙酰甲膽堿及磷酸組胺引喘豚鼠的影響

相較于模型組,痰喘寧合劑各劑量組、氨溴特羅組、小青龍合劑組引喘潛伏期均延長(P＜0.01)。結果見表5。

表2 痰喘寧合劑對OVA 所致哮喘大鼠血清IgE、IL-4、IL-17 及TNF-α 水平的影響(n＝12)Table 2 Effect of Tanchuanning Mixture on the levels of serum IgE, IL-4, IL-17 and TNF-α in asthmatic rats induced by OVA

表2 痰喘寧合劑對OVA 所致哮喘大鼠血清IgE、IL-4、IL-17 及TNF-α 水平的影響(n＝12)Table 2 Effect of Tanchuanning Mixture on the levels of serum IgE, IL-4, IL-17 and TNF-α in asthmatic rats induced by OVA

注：與正常組相比, bP ＜0.01；與模型組相比,cP ＜0.05, dP ＜0.01.Note.Compared with the normal group, bP ＜0.01.Compared with the model group, cP ＜0.05, dP ＜0.01.

組別Groups劑量(mL/kg)Dose IgE (U/mL) IL-4 (ng/L) IL-17 (ng/L) TNF-α (ng/L)正常組Normal group - 6.40±1.38 34.25±4.25 45.65±10.94 60.19±16.62模型組Model group - 11.44±5.36b 47.27±16.07b 86.35±41.51b 110.73±65.31b醋酸地塞米松組Dexamethasone acetate group 0.55(mg/kg) 6.14±3.47d 28.55±10.60d 41.73±24.33d 46.81±30.94d小青龍合劑組Xiaoqinglong Mixture group 4.00 8.59±1.19 38.43±5.28 56.90±9.51d 75.30±19.49痰喘寧合劑低劑量組Tanchuanning Mixture low dosage group 7.50 9.06±4.12 40.20±8.95 64.31±24.01 81.17±32.63痰喘寧合劑中劑量組Tanchuanning Mixture moderate dosage group 15.00 7.98±2.79 35.1±9.67c 53.26±16.17d 64.56±35.10c痰喘寧合劑高劑量組Tanchuanning Mixture high dosage group 30.00 10.20±3.97 43.92±12.94 69.01±32.59 97.46±51.16

表3 痰喘寧合劑對OVA 所致哮喘大鼠BALF 中WBC 及EOS 的影響(,n＝12)Table 3 Effect of Tanchuanning Mixture on WBC and EOS in BALF of OVA-induced asthma rats

表3 痰喘寧合劑對OVA 所致哮喘大鼠BALF 中WBC 及EOS 的影響(,n＝12)Table 3 Effect of Tanchuanning Mixture on WBC and EOS in BALF of OVA-induced asthma rats

注：與正常組相比,bP ＜0.01；與模型組相比, dP ＜0.01.Note.Compared with the normal group, bP ＜0.01.Compared with the model group, dP ＜0.01.

組別Groups劑量(mL/kg)Dose WBC(107/L) EOS(%)正常組Normal group - 15.08±2.91 1.67±1.15模型組Model group - 46.08±8.35b 5.92±1.88b醋酸地塞米松組Dexamethasone acetate group 0.55(mg/kg) 31.17±6.51d 3.50±1.31d小青龍合劑組Xiaoqinglong Mixture group 4.00 33.25±6.84d 3.58±1.44d痰喘寧合劑低劑量組Tanchuanning Mixture low dosage group 7.50 35.58±6.89d 3.75±1.36d痰喘寧合劑中劑量組Tanchuanning Mixture moderate dosage group 15.00 33.42±6.64d 3.42±1.24d痰喘寧合劑高劑量組Tanchuanning Mixture high dosage group 30.00 33.67±5.53d 3.25±1.54d

表4 痰喘寧合劑對OVA 所致支氣管哮喘大鼠肺組織病變程度的影響(n＝12)Table 4 Effect of Tanchuanning Mixture on the degree of lung tissue lesion in bronchial asthma rats induced by OVA

表4 痰喘寧合劑對OVA 所致支氣管哮喘大鼠肺組織病變程度的影響(n＝12)Table 4 Effect of Tanchuanning Mixture on the degree of lung tissue lesion in bronchial asthma rats induced by OVA

注：與正常組相比, bP ＜0.01；與模型組相比,cP ＜0.05, dP ＜0.01。Note.Compared with the normal group, bP ＜0.01.Compared with the model group, cP ＜0.05, dP ＜0.01.

組別Groups劑量(mL/kg)Dose病變程度Grade of pathological changes 0 級Grade 0 I 級Grade I II 級Grade II評分Score正常組Normal group - 8 4 0 0.33±0.49模型組Model group - 0 6 6 1.50±0.52b醋酸地塞米松組Dexamethasone acetate group 0.55(mg/kg) 2 8 2 1.00±0.60c小青龍合劑組Xiaoqinglong Mixture group 4.00 0 3 9 1.75±0.45痰喘寧合劑低劑量組Tanchuanning Mixture low dosage group 7.50 1 8 3 1.16±0.57痰喘寧合劑中劑量組Tanchuanning Mixture moderate dosage group 15.00 2 8 2 1.00±0.60c痰喘寧合劑高劑量組Tanchuanning Mixture high dosage group 30.00 3 9 0 0.75±0.45d

圖1 痰喘寧合劑對OVA 所致哮喘大鼠肺組織病理的影響(HE 染色)Note.A, Normal group.B, Model group.C, Dexamethasone acetate group.D, Xiaoqinglong Mixture group.E, Low dosage group.F,Moderate dosage group.G,High dosage group.Figure 1 Effect of Tanchuanning Mixture on the pathology of lung tissue in asthma rats induced by OVA (HE staining)

2.2 痰喘寧合劑鎮咳作用研究

2.2.1 痰喘寧合劑對枸櫞酸引咳豚鼠的影響

相較于模型組,痰喘寧合劑中、高劑量組,氨溴特羅組,小青龍合劑組咳嗽潛伏期均延長(P＜0.01),低劑量組咳嗽潛伏期有延長趨勢(P＞0.05)。 相較于模型組,痰喘寧合劑各劑量組、氨溴特羅組、小青龍合劑組咳嗽次數減少(P＜0.01 或P＜0.05)。 結果見表6。

2.2.2 痰喘寧合劑對氨水引咳小鼠的影響

相較于模型組,痰喘寧合劑各劑量組,氨溴特羅組,小青龍合劑組咳嗽潛伏期均延長(P＜0.01)；相較于模型組,痰喘寧合劑各劑量組、氨溴特羅組、小青龍合劑組咳嗽次數均減少(P＜0.01)。 結果見表7。

2.3 痰喘寧合劑祛痰作用研究

相較于模型組,痰喘寧合劑低、高劑量組,氨溴特羅組,小青龍合劑組氣管段酚紅排泌量均升高(P＜0.01 或P＜0.05)。 結果見表8。 酚紅標準曲線見圖2。

表5 痰喘寧合劑對豚鼠引喘作用的影響(,n＝10)Table 5 Effect of Tanchuanning Mixture on guinea pig's induced asthma

表5 痰喘寧合劑對豚鼠引喘作用的影響(,n＝10)Table 5 Effect of Tanchuanning Mixture on guinea pig's induced asthma

注：與模型組相比, bP ＜0.01。Note.Compared with the model group, bP ＜0.01.

組別Groups劑量(mL/kg)Dose引喘潛伏期(s)Induced asthma incubation period模型組Model group - 34.1±6.66氨溴特羅組Ambroxol Group 4.5 94.3±28.99b小青龍合劑組Xiaoqinglong Mixture group 4.5 59.7±13.37b痰喘寧合劑低劑量組Tanchuanning Mixture low dosage group 8.4 62.9±19.46b痰喘寧合劑中劑量組Tanchuanning Mixture moderate dosage group 16.8 67.4±14.57b痰喘寧合劑高劑量組Tanchuanning Mixture high dosage group 33.6 69.8±8.33b

表6 痰喘寧合劑對枸櫞酸引咳豚鼠的影響(,n＝10)Table 6 Effect of Tanchuanning Mixture on citrate guinea pig

表6 痰喘寧合劑對枸櫞酸引咳豚鼠的影響(,n＝10)Table 6 Effect of Tanchuanning Mixture on citrate guinea pig

注：與模型組相比,aP ＜0.05, bP ＜0.01.Note.Compared with the model group, aP ＜0.05, bP ＜0.01.

組別Groups劑量(mL/kg)Dose咳嗽潛伏期(s)Cough latency咳嗽次數(次)Number of coughs (times)模型組Model group - 108.7±44.07 24.1±9.49氨溴特羅組Ambroxol Group 4.5 170.9±38.95b 6.3±4.08b小青龍合劑組Xiaoqinglong Mixture group 4.5 211.1±62.64b 4.8±2.09b痰喘寧合劑低劑量組Tanchuanning Mixture low dosage group 8.4 115.2±63.97 14.9±6.47a痰喘寧合劑中劑量組Tanchuanning Mixture moderate dosage group 16.8 168.9±38.22b 5.8±3.55b痰喘寧合劑高劑量組Tanchuanning Mixture high dosage group 33.6 197.9±57.02b 4.1±2.28b

表7 痰喘寧合劑對氨水引咳小鼠的影響(n＝12)Table 7 Effect of Tanchuanning Mixture on mice induced by cough with ammonia

表7 痰喘寧合劑對氨水引咳小鼠的影響(n＝12)Table 7 Effect of Tanchuanning Mixture on mice induced by cough with ammonia

注：與模型組相比, bP ＜0.01。Note.Compared with the model group, bP ＜0.01.

組別Groups劑量(mL/kg)Dose咳嗽潛伏期(s)Cough latency咳嗽次數(次)Number of coughs (times)模型組Model group - 51.92±13.91 45.42±9.37氨溴特羅組Ambroxol Group 5.70 108.25±31.83b 11.33±4.50b小青龍合劑組Xiaoqinglong Mixture group 6.50 115.92±20.87b 11.42±4.19b痰喘寧合劑低劑量組Tanchuanning Mixture low dosage group 5.72 69.08±26.42b 30.33±11.83b痰喘寧合劑中劑量組Tanchuanning Mixture moderate dosage group 11.43 87.75±23.13b 24.08±14.52b痰喘寧合劑高劑量組Tanchuanning Mixture high dosage group 22.85 92.67±19.80b 22.25±12.06b

表8 痰喘寧合劑對小鼠氣管段酚紅排泌量的影響( ,n＝12)Table 8 Effect of Tanchuanning Mixture on the excretion of phenol red in tracheal segment of mice

表8 痰喘寧合劑對小鼠氣管段酚紅排泌量的影響( ,n＝12)Table 8 Effect of Tanchuanning Mixture on the excretion of phenol red in tracheal segment of mice

注：與模型組相比,aP ＜0.05, bP ＜0.01。Note.Compared with the model group, aP ＜0.05, bP ＜0.01.

組別Groups劑量(mL/kg)Dose酚紅濃度(μg/mL)Phenol red concentration模型組Model group - 0.075±0.0048氨溴特羅組Ambroxol Group 5.70 0.088±0.013b小青龍合劑組Xiaoqinglong Mixture group 6.50 0.094±0.018b痰喘寧合劑低劑量組Tanchuanning Mixture low dosage group 5.72 0.090±0.013b痰喘寧合劑中劑量組Tanchuanning Mixture moderate dosage group 11.43 0.082±0.012痰喘寧合劑高劑量組Tanchuanning Mixture high dosage group 22.85 0.087±0.018a

圖2 酚紅的標準曲線Figure 2 Standard curve of phenol red

3 討論

兒童咳嗽、咳喘易反復發作,最終可引發哮喘。痰喘寧合劑組方是閆慧敏教授在老專家劉韻遠先生治療咳喘經驗方的基礎上,根據當代兒童咳喘特點進行加減化裁而成[3],全方由炙麻黃、白果、醋五味子、干姜、炒紫蘇子、白前、蜜百部、川芎、青黛等12 味中藥組成,有宣肺化痰、止咳平喘功效,作為北京兒童醫院的協定處方及院內制劑在臨床用于兒童咳喘的治療已有二十余年,尤其在治療痰濕蘊肺型患兒方面,療效確切。 本實驗對痰喘寧合劑平喘、鎮咳和祛痰作用進行了研究。

哮喘患者因炎癥導致氣道狹窄造成氣道阻力增大,最終表現出咳喘,呼吸急促等表現[7]。 氣道高反應性是評判哮喘模型是否成功的重要客觀性指標之一。 動物實驗中多采用有創或無創方法進行氣道阻力測定來反映氣道順應性情況[8]。 本實驗結果顯示,相比于正常組,模型組氣道阻力隨乙酰甲膽堿濃度升高而顯著升高,提示本研究大鼠哮喘模型復制成功；相比于模型組,痰喘寧合劑低劑量組氣道阻力顯著降低,中、高劑量組有一定降低趨勢,提示痰喘寧合劑對氣道高反應性具有一定的降低作用。

哮喘是IgE 介導的以炎性細胞浸潤,炎性因子分泌增多為主要特征的呼吸系統疾病。 IgE 與肥大細胞和嗜堿性粒細胞的IgE 受體結合并激活細胞,釋放組胺及炎癥介質,引發炎癥反應[9]。 Th1/Th2細胞失衡學說是哮喘發病機制之一[10]。 Th2 細胞介導嗜酸性細胞炎癥反應。 炎性因子IL-4 由Th2細胞分泌,而IL-4 分泌增多可導致嗜酸性粒細胞的蓄積,加重炎癥反應。 IL-4 還可促進IgE 的合成,從而加重氣道炎癥[11]。 本研究中,模型組血清IgE、IL-4 水平顯著升高,痰喘寧合劑中劑量組IL-4 水平明顯降低,痰喘寧合劑各劑量組IgE 均呈下降趨勢。研究表明,Th2 細胞優勢在揭示哮喘發作機制方面稍顯不足,Th17 細胞也參與了哮喘的發生發展[12]。IL-17 由Th17 細胞分泌,不僅參與Th17 細胞介導的嗜中性細胞氣道炎癥,還可加重Th2 細胞誘導的嗜酸性細胞炎癥[13]。 TNF-α 是常見的內源性炎性因子,通過募集炎性細胞,促進其他炎性因子的釋放使炎癥加重,還可引起氣道高反應性[14],增加氧化應激參與哮喘的發生發展[15]。 臨床研究表明,在哮喘患者的肺組織及痰液中檢測到高水平的TNF-α。本研究顯示,痰喘寧合劑可降低IL-17、TNF-α 水平,減少BALF 中WBC 及EOS 數量,減輕大鼠肺組織病理損害和氣道炎癥。

乙酰膽堿作為一種神經遞質,可促進肺泡巨噬細胞釋放趨化因子,使大量炎性細胞及炎性因子聚集在氣道平滑肌,增強其收縮能力,加重哮喘病情[16]。 組胺由肥大細胞釋放,當機體受到過敏原刺激時,組胺釋放增多,造成氣道狹窄,呼吸困難。 在豚鼠實驗中,磷酸組胺可通過其受體,使氣道平滑肌收縮增強,加重氣道炎癥。 因此,本研究采用二者結合的方式,研究痰喘寧合劑的平喘作用。 結果顯示,豚鼠出現明顯的呼吸困難,喘息甚至跌倒癥狀,而痰喘寧合劑各劑量組可明顯延長豚鼠的引喘潛伏期,提示痰喘寧合劑可顯著改善氣道平滑肌痙攣等癥狀,具有一定的平喘作用。

咳嗽是咳嗽中樞受到外界刺激的一種生理反應,咳嗽反復發作極大地影響了患者的生活質量[17]。 咳嗽反射弧包括感受器、傳入神經、神經中樞、效應器、傳出神經,對反射弧中的感受器和傳出神經進行刺激最易引發咳嗽反應。 本研究采用氨水及枸櫞酸引咳小鼠及豚鼠,結果表明痰喘寧合劑各劑量組均能明顯延長咳嗽潛伏期及減少咳嗽次數,鎮咳作用明顯。

痰液由氣管及支氣管黏膜分泌。 正常狀態下,痰液分泌較少,可濕潤呼吸道。 疾病狀態下,痰液過于黏稠,不易排出,可引起氣道狹窄,從而加重病情[18]。 祛痰藥物多為降低痰液黏稠度,促進痰液排出。 祛痰作用實驗中,酚紅作為指示劑,可通過其排泌量的多少間接評價藥物的祛痰效果。 結果表明,痰喘寧合劑可增加小鼠氣管段的酚紅排泌量,提示痰喘寧合劑對痰液的排出有一定的促進作用。

以上研究結果表明,痰喘寧合劑具有一定的平喘、鎮咳、祛痰作用,但其作用機制尚需進一步研究。