DOX 調控HNRNPK 穩定下調的H1299 細胞株的構建與研究

李夢媛楊星九張文龍李維莎曹 琳劉宏飛高 苒

(中國醫學科學院醫學實驗動物研究所,國家衛生健康委員會人類疾病比較醫學重點實驗室,北京市人類重大疾病實驗動物模型工程技術研究中心,北京 100121)

核不均一核糖核蛋白 K (heterogeneous nuclearribonucleoprotein K,HNRNPK)是hnRNPs 家族成員之一,其基因位于人第9 號染色體q21.32 ～q21.33,序列高度保守,含有3 個K 同源區(K homologue, KH),每個K 同源區由65～70 個氨基酸組成,該區域能夠與RNA 和DNA 結合并相互作用[1-2]。 HNRNPK 還含有一個核定位信號(nuclear localization signals, NLS)以及一個核穿梭結構域(nuclear shuttling domain, KNS)[3]； NLS 調 節HNRNPK 從胞漿到核的轉運,KNS 則通過核孔復合物調節雙向穿梭[4]。 HNRNPK 特殊的分子結構使其能夠參與轉錄調控、RNA 加工與翻譯以及轉錄后修飾等多種細胞進程[5]。 大量研究顯示HNRNPK與目前威脅人類生命的腫瘤疾病密切相關,多種腫瘤的形成和發展都與該家族蛋白有關[1]。

HNRNPK 在原發性和轉移性肺癌中高表達[6],而其在多種腫瘤中的高表達通常與不良預后相關[7-8]。 然而HNPNPK 在肺癌中的具體作用機制仍然未知,需要進一步研究。 本實驗構建了熒光素酶標記的由強力霉素(doxycycline, DOX) 調控HNRNPK 穩定下調的H1299 細胞株,旨在為進一步研究HNRNPK 在肺癌發生發展中的作用機制提供實驗基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗細胞

H1299 細胞購自中國醫學科學院基礎醫學研究所。

1.2 主要試劑與儀器

PBS、RPMI 1640 培養基、0.25%胰蛋白酶、胎牛血清等購自美國Gibco 公司；D-Luciferin 購自北京泛博生物化學有限公司；TRIzol 試劑購自Invitrogen公司；反轉錄試劑盒、購蛋白預染Marker 自Thermo Fisher 公司；SYBR green 熒光染料購自日本Toyobo公司；定量PCR 專用96 孔板購自ABI 公司；HNRNPK 抗體購自Abcam 公司；p53、p21、CCND1抗體購自CST 公司；Rb、磷酸化Rb、CDK4、Cyclin-D1 等抗體購自Santa Cruz 公司；HRP 標記的山羊抗兔IgG 購自中杉金橋生物公司；CCK-8 細胞活性檢測試劑盒、Annexin V(633)凋亡檢測試劑盒購自東仁化學科技(上海)有限公司；嘌呤霉素購自Merk公司；DOX 由上海吉凱基因科技有限公司提供。

實時熒光定量PCR 儀為BIO-RADCFX Connect Real-Time PCR System； 酶 標 儀 為 BIORADiMarkMicroplate Reader； 流 式 細 胞 儀 為 BD FACSAria II Cell Sorter；活體光學成像系統為IVISLumina II。

引物合成與DNA 測序服務由英濰捷基(上海)公司提供。 HNRNPK 的siRNA 由本實驗室設計,序列如表1 所示,帶有DOX 識別位點的干擾慢病毒載體由上海吉凱基因科技有限公司構建。

1.3 實驗方法

1.3.1 病毒感染與穩轉株的篩選

慢病毒的轉染嚴格按照吉凱基因慢病毒使用操作手冊進行。 復蘇并培養H1299 細胞,調整細胞狀態。 將其制備成每毫升5×104個細胞濃度的懸液,接種于6 孔細胞培養板。 37℃培養18 h 后,稀釋病毒至MOI＝10,感染細胞,繼續培養8 h,觀察細胞狀態并更換培養基。 感染病毒72 h 后,用6 μg/mL 嘌呤霉素篩選細胞48 h,在顯微鏡下觀察細胞生長狀態,將陽性細胞進行擴大培養,并用3 μg/mL嘌呤霉素維持培養。

1.3.2 DOX 誘導后H1299 細胞的生長狀態

將篩選后的細胞制備成每毫升5×104個細胞濃度的懸液,每孔100 μL 接種于96 孔細胞培養板。繼續培養6～8 h,待細胞貼壁后用工作濃度為5 μg/mL 的DOX 誘導細胞,37℃繼續培養48 h。 在顯微鏡下觀察DOX 誘導前后細胞的生長狀態。

1.3.3 穩轉株熒光素酶活性的檢測

慢病毒載體帶有熒光素酶表達序列,檢測穩轉株中熒光素酶的活性。 用無菌ddH2O 溶解DLuciferin 干粉,并用0.22 μm 濾膜過濾除去雜質,儲備液濃度為30 mg/mL,分裝后于-20℃冰箱保存。用37℃預熱好的完全培養基按體積比1 ∶200 稀釋D-Luciferin 儲備液,配制成終濃度為150 μg/mL 的工作液。 去除步驟1.3.2 中細胞的培養上清,按100 μL/孔加入D-Luciferin 工作液,避光孵育10 min后,進行圖像分析。

1.3.4 Real-time PCR 檢測穩轉株HNRNPK 的表達效率

將細胞制備成每毫升5×104個細胞濃度的懸液,每孔1 mL 接種于12 孔細胞培養板,繼續培養6～8 h,待細胞貼壁后用0 ～10 μg/mL 不同濃度的DOX 誘導細胞,37℃繼續培養48 h。

依據TRIzol 試劑與反轉錄試劑盒說明書操作步驟收集各孔細胞并提取獲得細胞的總RNA,進行反轉錄得到cDNA。 應用Real-time PCR 進行檢測,并通過閾值循環數計算各組細胞中HNRNPK 的相對表達量。 實驗中,GAPDH 與HNRNPK 基因的上下游引物序列如表2 所示,反應體系的成分配制如表3 所示,設定反應程序：95℃3 min；95℃10 s,60℃30 s,擴增40 個循環；熔解曲線為60℃～95℃升溫。 實驗結束后通過HNRNPK 的相對表達量找出DOX 誘導穩轉細胞株穩定下調HNRNPK 的最佳濃度。

1.3.5 Western blot 檢測穩轉株HNRNPK 的表達水平

將細胞制備成每毫升5×104個細胞濃度的懸液,每孔1 mL 接種于12 孔細胞培養板,繼續培養6～8 h,待細胞貼壁后用工作濃度為5 μg/mL 的DOX誘導細胞,37℃繼續培養48 h。

收集培養板中各孔的細胞,通過RIPA 裂解液裂解細胞提取蛋白,檢測并調整各組細胞的蛋白濃度。 配制濃度為12%的分離膠,進行SDS-PAGE 電泳。 然后,按300 mA 電流強度進行轉膜,將蛋白條帶轉至PVDF 膜上。 用含5%脫脂奶粉的封閉液于室溫封閉PVDF 膜1 h,以減少非特異性結合。 隨后按1 ∶1000 的比例稀釋HNRNPK 抗體,于4℃孵育PVDF 膜。 次日,用0.1%的PBST 洗膜3 次,加入稀釋比例為1 ∶10000 的HRP 標記的IgG,于室溫孵育1 h。 再次洗膜3 次后加顯影液,觀測各組蛋白條帶的大小與位置。

1.3.6 HNRNPK 下調對H1299 細胞增殖的影響

制備細胞懸液并計數,按3×103個/孔將細胞接種于96 孔細胞培養板,37℃培養6 ～8 h,待細胞貼壁后用工作濃度為5 μg/mL 的DOX 溶液持續誘導培養細胞。 接種當天待細胞貼壁后,取一組細胞培養上清,按CCK-8：培養上清體積比為1 ∶100 的比例加入CCK-8, 在CO2培養箱中繼續培養2 h,觀察顯色程度,用酶標儀測定其在450 nm 波長處的吸光度,其后每隔24 h 檢測一次培養上清的OD450,直至第96 h。

1.3.7 HNRNPK 下調對H1299 細胞凋亡的影響

將細胞制備成每毫升5×104個細胞濃度的懸液,每孔2 mL 接種于6 孔細胞培養板,繼續培養6～8 h,待細胞貼壁后用工作濃度為5 μg/mL 的DOX誘導細胞,37℃繼續培養48 h。

細胞凋亡的檢測嚴格按照AnnexinV(633)凋亡檢測試劑盒說明書進行。 收集6 孔板中的細胞,用適量的培養基將細胞懸液轉移至離心管中,1000 r/min 離心3 min,棄去上清。 加入PBS 溶液離心洗滌細胞兩次,用100 μL 稀釋好的1×Annexin V Binding Solution 重懸細胞,分別向細胞懸液中加入5 μL Annexin V(APC)結合物與5 μL PI Solution(PE),室溫下避光孵育15 min。 加入400 μL 1×Annexin V Binding Solution,通過流式細胞儀對細胞的凋亡情況進行檢測。

1.3.8 HNRNPK 下調對H1299 細胞周期的影響

培養、收集細胞步驟同1.3.7。 用預冷的PBS洗滌細胞兩次,然后用70%的乙醇固定細胞。 加入PBS 離心洗滌除去乙醇后,加入含0.1%RNaseA 的PI 染液,室溫避光染色30 min,通過流式細胞儀檢測細胞周期。

1.3.9 HNRNPK 下調對H1299 細胞增殖相關的信號通路的影響

步驟同1.3.5,檢測p53、p21、CCND1、Rb、p-Rb、Cyclin-D1、CDK4 等蛋白的表達水平。

1.4 統計學方法

數據分析采用GraphPad Prism V.5.0 軟件,計量資料以平均數±標準差()表示,對數據進行t檢驗以及統計學分析,以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 DOX 誘導HNRNPK 下調后H1299 細胞的生長狀態

細胞狀態如圖1 所示,感染病毒的H1299 細胞與對照組細胞在大小、形態上并無明顯差異。 但DOX 誘導48 h 后二者的生長密度明顯不同,可能在HNRNPK 下調后,H1299 細胞的增殖速度受到了影響。

2.2 穩轉株熒光素酶活性的檢測

實驗結果如圖2 所示,與未感染慢病毒的H1299 細胞對比,空白對照病毒組與HNRNPK 干擾病毒組的細胞均具備熒光素酶活性,能夠發出明顯的熒光。

2.3 H1299 穩轉株HNRNPK 的表達效率

定量PCR 結果如圖3A 所示,經不同濃度的DOX 誘導48 h 后,H1299 穩轉株中HNRNPK 的mRNA 表達水平明顯下調。 在DOX 濃度為5 μg/mL 與10 μg/mL 時,HNRNPK 的mRNA 表達水平能夠下調約65%～70%,且在這兩個濃度下HNRNPK的相對表達量并無顯著差異,表明DOX 誘導穩轉細胞株中HNRNPK 下調的最佳濃度為5 μg/mL。Western blot 結果如圖3B 所示,在5 μg/mL 的DOX誘導48 h 后,H1299 穩轉株中HNRNPK 的蛋白表達也被下調。

2.4 HNRNPK 下調對H1299 細胞增殖的影響

通過CCK-8 細胞活性檢測試劑盒檢測細胞增殖,結果如圖4 所示,在DOX 的誘導下,HNRNPK穩定下調的H1299 細胞增殖速度明顯減慢,與對照組比較,二者有顯著差異,表明HNRNPK 下調能夠抑制H1299 細胞的增殖。

2.5 HNRNPK 下調對H1299 細胞凋亡的影響

經DOX 誘導細胞48 h 后,通過Annexin V(633)凋亡檢測試劑盒檢測凋亡細胞數量。 結果如圖5 所示,HNRNPK 穩定下調的H1299 細胞的凋亡數量與對照組比較,并無顯著差異,表明HNRNPK下調對H1299 細胞的凋亡沒有明顯影響。

2.6 HNRNPK 下調對H1299 細胞周期的影響

通過PI 染色檢測細胞周期,結果如圖6 所示,HNRNPK 下調后,G0/G1期細胞的百分比明顯高于對照組,S 期細胞的百分比則明顯低于對照組,差異有統計學意義(P＜0.05)；G2/M 期細胞的百分比差異無統計學意義(P＞0.05)。 表明HNRNPK 的下調抑制了H1299 細胞從G0/G1期向S 期發展的周期進程。

2.7 HNRNPK 下調對H1299 細胞增殖相關的信號通路的影響

經DOX 誘導細胞48 h 后,通過Western blot 檢測細胞中p53、p21 等蛋白的表達水平。 結果如圖7所示,H1299 作為p53 缺失的細胞株,細胞中檢測不到p53 表達；而在HNRNPK 表達下調后,p21 的表達水平上調,CCND1 與Cyclin-D1 的表達水平下調；CDK4 與Rb 蛋白的表達水平沒有明顯變化,但Rb蛋白的磷酸化水平下調。

表1 siRNATable 1 siRNA

表2 Real-time PCR 引物序列Table 2 Primer sequences for the Real-time PCR assay

圖1 DOX 誘導后H1299 細胞的生長狀態Note.A, Group of LV-NC-RNAi.B,Group of LV-HNRNPK-RNAi.C, Group of LV-NC-RNAi after 48 h.D,Group of LV-HNRNPK-RNAi after 48 h.Figure 1 Cellular states of H1299 cells after DOX induction

表3 Real-time PCR 反應體系Table 3 Real-time PCR reaction components

圖2 穩轉株熒光素酶活性的檢測Figure 2 Detection of luciferase in stable transgenic cell line

圖3 不同劑量DOX 誘導HNRNPK 下調的表達效率(n＝3)Note.A, qPCR.B, Western blot.Compared with the control group, ***P＜0.001.Figure 3 HNRNPK downregulated by different doses of DOX

3 討論

圖4 HNRNPK 下調對H1299 細胞增殖的影響Note.Compared with the control group,n ＝3,**P＜0.01,***P＜0.001.Figure 4 Effects on H1299 cells proliferationof HNRNPK downregulation

目前,大量研究已證實HNRNPK 在各種腫瘤組織中高表達,且與口腔鱗狀細胞癌、前列腺癌、胃癌、結直腸癌、膀胱癌、鼻咽癌及黑色素瘤等的預后呈負相關,但其對于肺癌與肝癌的預后情況仍然未知[9-10]。 HNRNPK 的異常表達在不同腫瘤中發揮的功能也各不相同。 Gallardo 等[11]通過構建HNRNPK 基因敲除雜合子(Hnrnpk+/-)小鼠,證實HNRNPK 在血液系統惡性腫瘤中發揮抑癌基因的作用。 Huang 等[12]發現過表達的HNRNPK 能夠通過調節p53 相關信號通路抑制胃癌。 Li 等[13]研究發現HNRNPK 在神經母細胞瘤患者的腫瘤中高表達并伴有不良預后。 非小細胞肺癌(non-small-cell lung carcinom,NSCLC)是最常見的肺癌類型,是我國城市人口惡性腫瘤死亡的主要原因[14]。 陳燕等[6]發現HNRNPK 在肺癌原發灶及支氣管切緣組肺癌組織中高表達,而在正常組織及炎性對照組中的表達率則相對較低。 同時,HNRNPK 在肺癌轉移及浸潤組織中高陽性表達,提示HNRNPK 的高表達可能與肺癌的轉移有關。 然而,HNPNPK 在肺癌發生發展中的具體作用機制尚不完全清楚。

圖5 HNRNPK 下調對H1299 細胞凋亡的影響Note.A, Group of LV-NC-RNAi.B, Group of LV-HNRNPK-RNAi.C, Percent of apoptotic cells.Compared with the control group,n ＝3.Figure 5 Effects on H1299 cells apoptosis of HNRNPK down regulation

圖6 HNRNPK 下調對H1299 細胞周期的影響(n＝3)Note.Compared with the control group,*P＜0.05.Figure 6 Effects on cell cycle of HNRNPK downregulation in H1299 cells

圖7 HNRNPK 下調對H1299 細胞增殖相關的信號通路的影響Figure 7 Effects on proliferation relatedsignalingpathwaysof HNRNPK downregulationin H1299 cells

HNRNPK 在多種腫瘤的發生發展中參與調控癌基因與抑癌基因的表達,并參與調控腫瘤細胞的增殖、凋亡、遷移與侵襲等多種生物學過程[9]。Huang 等[12]研究發現過表達的HNRNPK 能夠通過調控細胞周期相關蛋白p53/p21/Cyclin-D1 抑制胃癌細胞增殖與腫瘤生長。 Chen 等[15]研究顯示HNRNPK 能夠通過調控Cyclin-D1 與細胞周期G0/G1期開關蛋白2 等促進膀胱癌細胞的增殖。HNRNPK 作為轉錄因子能夠與eIF4E 的啟動子結合,同時與p21 mRNA 的3′端非翻譯區域結合,以此抑制p21 翻譯,進而促進翻譯起始、細胞分裂和腫瘤形成[7,16]。 此外,在多種腫瘤組織中,HNRNPK 的高表達通常伴隨著高水平的c-myc,HNRNPK 能夠通過與c-myc 啟動子的poly(C)結合促進c-myc 轉錄,參與腫瘤細胞的增殖調控[5]。 因此,HNRNPK能夠通過多種途徑參與腫瘤細胞的增殖調控。HNRNPK 也能夠通過多種途徑參與腫瘤細胞的凋亡調控。 Chen 等[17]的研究中發現HNRNPK 能夠通過調節下游的抗凋亡基因發揮抗凋亡活性,HNRNPK 在鼻咽癌細胞中能夠與抗凋亡基因FLIP的啟動子結合并導致其轉錄激活。 Yang 等[18]的研究發現HNRNPK 第296 與299 位精氨酸的甲基化能夠抑制促凋亡激酶PKCδ 介導的第302 位絲氨酸磷酸化,進而抑制DNA 損傷誘導的凋亡。 HNRNPK作為p53 的共激活因子對調節DNA 損傷修復起重要作用,DNA 損傷促使HNRNPK 被募集到p53 下游基因的啟動子,促使p21、HDM2、C/EBPα 和C/EBPβ 表達；HNRNPK 的下調減少p53 轉錄,從而導致DNA 損傷誘導的細胞周期停滯[19]。

本實驗中成功構建了熒光素酶標記的由DOX調控HNRNPK 穩定下調的H1299 細胞株,能夠通過DOX 選擇性地誘導細胞在特定時間點下調HNRNPK 表達。 人非小細胞肺癌細胞H1299 來源于淋巴結轉移,其均一性地缺失p53 蛋白表達[20]。已有研究證實HNRNPK 能夠與p21 mRNA 的3′端非翻譯區域結合,抑制p21 翻譯,從而促進腫瘤發生[7]。 癌基因CCND1 能夠編碼G1/S-特異性周期蛋白Cyclin-D1,其能夠通過與p21 相互作用使細胞周期進程從G1期向S 期發展。 Cyclin-D1 的主要功能是促進細胞增殖,其過度表達可能導致細胞失控或癌變。 Cyclin-D1 能夠結合并激活G1期特有的周期蛋白依賴性激酶CDK4,CDK4 能夠磷酸化G1期周期抑制蛋白Rb,使其從所結合的E2F1 轉錄因子上解離,釋放E2F1,推動細胞周期由G1期進入S期,促進細胞增殖[21]。 本實驗中,HNRNPK 的下調使得p21 的表達升高,CCND1 與Cyclin-D1 的表達降低,從而使Rb 蛋白的磷酸化受到抑制,進一步抑制細胞周期進程從G1期向S 期發展。 因此,通過DOX 誘導HNRNPK 表達水平下調,可能通過調控p21 及其相關細胞周期調節蛋白的信號通路,從而抑制了H1299 細胞的增殖。 本實驗中,HNRNPK 的下調對H1299 細胞的凋亡沒有明顯影響,可能是由于H1299 細胞本身缺失p53 蛋白表達, 導致HNRNPK 表達下調后無法通過p53 及其下游信號通路參與細胞周期調控,因而不能引發細胞凋亡。綜上所述,本實驗中HNRNPK 的下調抑制了肺癌細胞的增殖,結合以往的研究[6,11-13],證實HNRNPK在肺癌中的高表達可能發揮著促進肺癌發展的作用,并進一步說明HNRNPK 的異常表達可能有著雙重功能,其在不同種類的腫瘤中能夠產生不同的影響。 此外,H1299 細胞中插入了熒光素酶表達序列,使其能夠在生物體內標記并跟蹤腫瘤細胞的成瘤部位、腫瘤大小與轉移情況,通過活體成像實時觀測腫瘤在生物體內的發展,一方面為研究HNRNPK在肺癌發生發展中的功能與機制提供了更便利的條件,同時也為抗腫瘤相關的基礎研究與臨床研究提供了理論基礎和實驗依據。