鼠痘病毒FQ-PCR 檢測方法的建立及初步應用

王莎莎付 瑞王 吉岳秉飛

(中國食品藥品檢定研究院,北京 102629)

鼠痘病毒(ectromelia virus,ECTV)是一類有囊膜,基因組為180 ～200 kb 大小的線性雙股DNA 病毒,是動物病毒中體積大、結構最復雜的DNA 病毒,病毒粒子呈卵圓形或磚形,大小為230 nm×170 nm,在分類上屬于痘病毒科,脊索動物痘病毒亞科,正痘病毒屬。 ECTV 的自然宿主為小鼠,1930 年首次在英國的實驗小鼠種群中分離,隨后在墨西哥、日本、美國、中國均有發現[1]。 ECTV 多呈爆發性流行,致死率較高,常造成全群淘汰,危害極大。 不同宿主的易感性不同,臨床上急性感染小鼠以四肢、尾和頭部腫脹、潰爛、壞死甚至腳趾脫落為特征,故又稱脫腳病,而隱性帶毒鼠通常沒有明顯癥狀,為實驗小鼠種群的重大安全隱患。 實驗室常用酶聯免疫吸附試驗檢測ECTV 抗體進行日常監測,而隱性帶毒鼠的血清抗體水平較低,血清學檢測方法有可能造成假陰性[2],且感染動物的病毒抗體的產生存在空窗期,因此,對實驗小鼠的ECTV 核酸篩查在感染初期非常重要。 本研究建立了ECTV 特異靈敏的TaqMan 探針法實時熒光定量PCR(fluorescence quantitative PCR,FQ-PCR)檢測方法,能夠實現快速批量檢測,且首次在黃鼠組織中檢測到ECTV 核酸,提示在使用實驗用動物時還需重視ECTV 的感染情況。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

22 只6 周齡雄性(18～22 g)清潔級小鼠來自中國食品藥品檢定研究院動物生產供應室[SCXK(京)2017-0005],[SYXK(京)2017-0013],63 只14～34 月齡屏障環境飼養裸鼴鼠,重22g ～42g, 其中雌性31 只,雄性32 只,由海軍軍醫大學提供[SCXK(滬)2017-0002]。 動物飼養于屏障設施[SYXK(滬)2017-0004]。 由中國食品藥品檢定研究院審批通過(中檢動(福)第2019(A)001 號),所有動物均按3R 原則給予人道的關懷。

1.1.2 實驗樣品與毒種

鼠痘病毒(ectromelia virus,ECTV)、牛痘病毒(vaccinia virus, VACV )、 鼠 腺 病 毒 ( murine adenovirus, MAdV)、 小 鼠 多 瘤 病 毒( murine polyomavirus ,Poly)、小鼠微小病毒(minute virus of mice,MVM)為本室保存；63 份裸鼴鼠脾組織樣本(編號為NP1～NP63 號)來自中國人民解放軍第二軍醫大學；22 只清潔級小鼠脾組織(編號為MS1 ～MS22)和4 只黃鼠的20 份組織樣本為本實驗室送檢樣品,來自于國內4 個實驗動物使用單位,其中黃鼠的組織包括肝組織(編號為SQLi1 ～SQLi4)、脾組織(編號為SQS1 ～SQS4)、腎組織(編號為SQK1 ～SQK4)、肺組織(編號為SQLu1 ～SQLu4)、淋巴組織(編號為SQLy1～SQLy4)。

1.2 主要試劑與儀器

DNA 快速提取試劑盒品牌為QIAGEN；普通PCR 系列試劑及標準陽性質粒均購自寶生物工程(大連)有限公司；TaqMan Gene Expression Master Mix 品牌為ABI。 PCR 儀和核酸瓊脂糖凝膠電泳儀品牌為為美國Bio-RAD；凝膠成像分析儀品牌為為美國Kodak；熒光定量PCR 儀7500fast Real-Time PCR System 品牌為美國ABI。

1.3 實驗方法

1.3.1 引物設計

比對NCBI 上現有的ECTV 基因序列,選擇同源性最高的crmD基因(NCBI ID：KJ563295)保守區域,設計FQ-PCR 的引物探針,序列如表1 示。

1.3.2 質粒標準品的制備

合成ECTV 基因crmD序列包含引物探針的部分,轉入pMD19-T 質粒中,作為ECTV FQ-PCR 的標準質粒pMD19-ECTV,濃度為1.0×109copies/μL。

1.3.3 病毒DNA 的獲取

對正常BHK21 細胞、BHK21 細胞培養的ECTV毒株和VACV、MAdV、Poly、MVM 病毒培養液,以及63 份裸鼴鼠脾組織樣本和22 份小鼠脾組織樣本、4只黃鼠的肝、脾、腎、肺、淋巴結等20 份組織樣本按照DNA 快速提取試劑盒操作方法進行DNA 提取。提取的DNA 凍存于-30℃備用。

1.3.4 ECTV FQ-PCR 擴增體系及標準曲線的建立

經條件優化, FQ-PCR 的最佳反應體系為引物探針混合物(10 μmol/L)1 μL,模板1 μL,加入TaqMan Gene Expression Master Mix 以及無RNase 水使總反應體積達到20 μL。 使用熒光定量PCR 儀7500fast Real-time PCR System 設定程序50℃預熱2 min；95℃預變性10 min；擴增循環為95℃ 15 s,60℃1 min,共40 個循環,在每個循環的延伸結束時進行熒光信號檢測。

將pMD19-ECTV 作為標準品,進行10 倍系列稀釋為1.0×109～1.0×100copies/μL,作為模板進行實時熒光定量PCR 反應,選取線性較好6 個稀釋度建立標準曲線。

1.3.5 ECTV FQ-PCR 檢測方法的特異性、靈敏性、準確性和穩定性檢測

表1 用于擴增crmD 基因的引物與TaqMan 探針序列Table 1 Pimers and TaqMan probes sequences for the crmD gene amplification

使用建立的FQ-PCR 方法檢測ECTV、VACV、MAdV、Poly、MVM 病毒核酸,并設立BHK21 細胞核酸和無RNase 水作為陰性對照(N/C)檢測ECTV FQ-PCR 方法的特異性。 檢測1.0×109～1.0×100copies/μL 的標準質粒,每個稀釋度做三個平行,檢測方法的靈敏性。 使用建立的FQ-PCR 方法對3 份陽性樣品進行多次重復實驗,評價方法的準確性和穩定性。

1.3.6 ECTV FQ-PCR 在不同樣品中的應用

使用建立的ECTV FQ-PCR 方法對1.3.3 中獲取的不同的樣本DNA 進行ECTV 篩查,并對陽性樣本使用普通PCR 引物crmD1 ∶5'-CTGCGAATTT GAAGGATC-3 '； crmD2： 5 '-CGTCGTGGGTGTTAG TTG -3'進行擴增[3],擴增產物測序鑒定。

2 結果

2.1 ECTV FQ-PCR 擴增體系及標準曲線的建立

選取標準質粒pMD19-ECTV 稀釋度為1.0×108～1.0×103copies/μL 的檢測結果制定標準曲線,標準曲線如圖1 所示,其相關系數Slope 為-3.487、相關系數R2值為0.998,擴增效率Eff%為93.544%(90%～110%之間)。

2.2 ECTV FQ-PCR 特異性檢測

如圖2 所示, 建立的ECTV FQ-PCR 檢測VACV、MAdV、Poly、MVM 病毒核酸以及BHK21 細胞核酸和無RNase 水均無明顯擴增曲線,而對ECTV 病毒DNA 有S 型擴增曲線,CT 值為12.29,說明建立的方法有很好的特異性。

2.3 ECTV FQ-PCR 靈敏性檢測

對1.0×109～1.0×100copies/μL 稀釋度的標準質粒pMD19-ECTV 進行檢測,每個稀釋度三個平行,所能檢測的最小濃度梯度的循環閾值(CT)≤35,拷貝數(Copies)≥10 時FQ-PCR 結果可信,結果如圖3,顯示標準質粒濃度為10 copies/μL 時CT 值為33.09,三個平行實驗均有擴增曲線,測得拷貝數為30.90 copies,在可信范圍之內,而濃度為1 copies/μL 時CT 值為36.01,測得的拷貝數為4.5 copies,但在三個平行實驗中,僅有一個實驗有數據,說明已超出檢測限。 因此確定該方法的靈敏度為10 copies。

2.4 ECTV FQ-PCR 準確性和穩定性檢測

圖1 ECTV FQ-PCR 標準曲線Note.Target, Target 1 Slope, -3.487.Y-lnter,38.291.R2,0.998.Eff%,93.544%.Figure 1 ECTV FQ-PCR standard curve

圖2 ECTV FQ-PCR 特異性檢測結果Note.1, ECTV.2-7, VACV/MAdV/Poly/MVM/BHK21 cell/RNase free water.Figure 2 ECTV FQ-PCR specificity test

圖3 ECTV FQ-PCR 靈敏度檢測擴增曲線Figure 3 ECTV FQ-PCR sensitivity test amplification curves

使用 濃 度 分 別 為1 × 106copies/μL、1 × 105copies/μL、1×104copies/μL 的標準品進行熒光定量PCR 檢測,且進行三個平行實驗,最終實測值的均值分別為1.2×106copies/μL、1.078×105copies/μL、1.33×104copies/μL,計算CTSD 值及CV 值如表2。3 個濃度梯度3 次重復實驗Ct 值的變異系數(CV)均小于5%,表明方法重復性、穩定性良好。

2.5 ECTV FQ-PCR 在鼠組織樣品中的應用

對收集到的動物組織樣本進行ECTV 篩查,結果如表3、圖4 所示,顯示在黃鼠的肝、脾、腎、肺、淋巴組織中均檢測到ECTV 陽性,陽性樣品中ECTV的核酸拷貝量均較低,其中濃度最高的是黃鼠淋巴組織SQLy1,達106.967 copies/μL,且淋巴組織的檢測結果均為陽性。 對陽性樣本進行PCR 后測序,顯示其與ECTV 核酸的同源性為99%,進一步驗證了檢測的黃鼠感染了ECTV。 而在實驗室裸鼴鼠組織和小鼠組織ECTV 篩查結果顯示均為陰性。

3 討論

鼠痘病毒作為我國現行國標《實驗動物微生物等級及檢測》(GB14922.2-2011)中規定的清潔級及以上級別小鼠的必檢項目[4],我國實驗室已經建立了較為嚴格的飼養管理及衛生防疫制度,對國內實驗室中的鼠痘病毒的流行情況進行了很好的控制。 現行國家標準中實驗動物鼠痘病毒的檢測方法為血清學方法,包括酶聯免疫吸附實驗、免疫酶試驗、免疫熒光試驗、免疫酶組織化學法,通常情況下,實驗室的標準檢測方法為酶聯免疫吸附試驗。據不完全統計,我國1983 年至2011 年間的7 篇關于ECTV 的報道,僅有兩篇報道檢出ECTV 陽性,且陽性率很低[5]。 近些年已經很少有關于ECTV 陽性的報道,本實驗室2017 至2019 年間使用酶聯免疫吸附試驗方法檢測小鼠血清中的ECTV 抗體,未檢出陽性,本實驗使用的小鼠、裸鼴鼠、黃鼠分別使用小鼠、裸鼴鼠、大鼠的鼠痘病毒酶聯免疫吸附試驗方法檢測為鼠痘抗體陰性。 由于分子學方法直接檢測抗原,且彌補了血清學檢測方法在感染空窗期檢測造成的假陰性,具有很好的應用前景。

為了全面的評價ECTV 對實驗室小鼠的感染威脅,本研究擬建立ECTV FQ-PCR 對裸鼴鼠、黃鼠、小鼠組織進行篩查。 選取了位于ECTV 核酸兩端的重復序列中的CrmD基因的保守區域設計引物探針,建立的ECTV Q-PCR 能夠靈敏特異的檢測ECTV 核酸,標準曲線的相關系數Slope 為-3.487、相關 系數 R2值 為 0.998, 擴 增 效 率 Eff% 為93.544%,最低能檢測到濃度為10copies 的樣品。

表2 熒光定量PCR 檢測方法的重復性和穩定性實驗結果Table 2 Repeatability and stability testing results of Q-PCR

表3 黃鼠組織樣本ECTV 檢測結果Table 3 Results of ECTV detection for ground squirrel tissue samples

圖4 黃鼠組織ECTV FQ-PCR 檢測的擴增曲線Figure 4 The amplification curve of ground squirrel tissue samples for ECTV FQ-PCR test

近些年關于ECTV 的分子學診斷方法得到了廣泛關注,分別針對ERPV_027 基因[6]、核心蛋白P4b基因[7]設計了熒光定量PCR 方法,針對CrmD基因建立了環介導等溫擴增可視化檢測方法[2]。 本研究針對CrmD基因建立FQ-PCR 方法,CrmD基因位于ECTV 的兩端重復序列中,相當于一個病毒粒子中含有2 個拷貝的基因,且CrmD基因與病毒繁殖方式有關[8],在感染組織中核酸峰度較高,進一步提高了檢測的靈敏度。 TaqMan 熒光定量PCR 方法具有靈敏度高、特異性強、操作簡便易于高通量檢測等優點,具有較高的適用性。

使用建立的ECTV FQ-PCR 檢測實驗室22 份小鼠組織,未檢測出陽性,說明國內屏障系統小鼠ECTV 的感染得到了很好的監測和控制。 檢測63份裸鼴鼠組織ECTV 結果為陰性,說明裸鼴鼠對ECTV 敏感性較低,但裸鼴鼠對ECTV 是否具有抗病毒作用還需要進一步的研究分析。 20 份黃鼠組織檢測出ECTV 陽性,說明黃鼠為ECTV 的易感宿主。 小鼠感染ECTV 時,首先通過皮下感染位點擴散至淋巴結,侵入血液后引發一級病毒血癥使病毒進入脾和肝[8]。 本研究在4 只黃鼠的淋巴結均檢測到ECTV,而在肝、脾、腎、肺組織僅有部分檢測出病毒,說明ECTV 在黃鼠體內有與小鼠相似的感染途徑。 使用ECTV FQ-PCR 黃鼠組織的檢出率為50%,但病毒的拷貝數都比較低,而使用血清學方法未檢出黃鼠鼠痘抗體陽性可能是由于此時正處于感染初期,為鼠痘抗體產生的空窗期,因此造成假陰性,也可能是由于使用大鼠的酶聯免疫吸附實驗與黃鼠中鼠痘抗體沒有交叉反應,造成陰性結果。黃鼠主要分布于我國北部和西部地區,由于其特有的生物學特性,已被大量用于醫學實驗和冬眠生理學的實驗材料,神經生物學工作者也開始使用黃鼠作為研究對象[9-10],也應用于病毒性肝炎的實驗動物模型[11]。 但是黃鼠的實驗動物化研究還存在很多空白,微生物攜帶情況及致病性研究為黃鼠飼養規范提供技術支持,有效促進黃鼠的實驗動物化進程。 同時,黃鼠感染ECTV 提示其作為新興實驗用動物使用時,需要避免其對實驗動物飼養環境的污染,以免引起ECTV 在實驗室小鼠的爆發。