競爭性內源RNA 在支氣管哮喘中的研究進展

何山川錢粉紅

(江蘇大學附屬醫院呼吸與危重癥醫學科,江蘇 鎮江 212000)

支氣管哮喘(簡稱哮喘)是一種遺傳因素與環境因素共同參與的免疫學疾病,是最常見的慢性氣道炎癥性疾病之一,臨床表現為反復發作的喘息、氣急、胸悶或咳嗽等癥狀,常在夜間及凌晨發作或加重,多數患者可自行緩解或經治療后緩解。 哮喘涉及平滑肌細胞、氣道上皮細胞、T 淋巴細胞、嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、肥大細胞等多種細胞及細胞組分,其特征是氣道炎癥、氣道高反應性和氣道重塑[1]。 據統計,中國20 歲以上成人哮喘總體患病率為4.2%,其中71.2%的哮喘患者從未得到明確診斷,只有5.6%的哮喘患者接受了吸入糖皮質激素治療[2]。 因此,深入研究探索哮喘的發病機制,尋找輔助診斷標志物和治療靶標,是目前研究的重要方向。 競爭性內源RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)假說由Salmena 等[3]提出,目前認為,參與ceRNA 調控網絡的RNA 包括信使RNA(message RNA, mRNA)、 微 小RNA (microRNA,miRNA)、假基因(pseudogene)、環狀RNA(circular RNA,circRNA)和長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)等,其中miRNA 是該網絡的核心[4]。研究表明,mRNA、假基因、lncRNA 和circRNA 可作為內源性miRNA 分子海綿,通過miRNA 結合位點競爭性結合相同的miRNA,從而調控基因表達[5],并在癌癥、心血管疾病和糖尿病等多種疾病中發揮重要作用。 本文現就ceRNA 調控機制及其在哮喘中的研究進展進行綜述。

1 ceRNA 調控機制概述

miRNA 是一類長度大約在20 ～22 個核苷酸且具有在轉錄后水平調控基因表達功能的非編碼RNA。 miRNA 可與其靶mRNA 的3'端非翻譯區(untranslated region,UTR)結合,導致翻譯抑制和(或) mRNA 降解[6]。 miRNA 應答元件(miRNA response element, MRE) 是 指 mRNA、 lncRNA、circRNA 等其他類型的RNA 轉錄本上與miRNA 互補性結合的一段序列,這種結合通常會抑制目標基因的表達[5]。 在ceRNA 調控機制中,MRE 是各種RNA 轉錄本交流的媒介,mRNA、lncRNA、circRNA等轉錄本均通過由MRE 介導的“語言”進行通訊,即具有相同MRE 的RNA 分子通過競爭性結合相同的miRNA 來調控miRNA 靶mRNA 的表達水平,從而構成龐大的調控網絡。 Ebert 等[7]報道人工合成含有多個相同的MRE 的miRNA“海綿”能夠特異且有效地抑制miRNA 功能。 而ceRNA 作用機制與人工合成的miRNA“海綿”大致相同,可靶向結合miRNA 并抑制miRNA 的活性,所以也被稱為內源性miRNA 海綿。

理論上,任何包含MRE 序列的RNA 轉錄本(包括mRNA)均可作為ceRNA,并通過競爭性結合同一種miRNA 影響各自的表達水平[5],其中lncRNA和circRNA 作為ceRNA 已被實驗證實。 lncRNA 是一類長度大于200 個核苷酸、不具備編碼蛋白質功能的RNA 分子,相當多的研究表明,lncRNA 在炎癥反應、細胞惡性轉化和腫瘤轉移等病理生理過程中發揮調控基因表達的關鍵作用[8-10]。 在呼吸系統疾病研究領域,有研究報道lncRNA 在哮喘、非小細胞肺癌、特發性肺纖維化等疾病中作為ceRNA 發揮調控作用,導致疾病進展[11-13]。 circRNA 是一類閉合環狀非編碼RNA,大量存在于真核細胞轉錄組中,參與轉錄和轉錄后基因的表達調控[14]。 由于circRNA 不易被核酸外切酶降解,且單個分子可包含多個MRE 序列,故較線性RNA 分子更高效、更持久地發揮ceRNA 功能[15]。 Hansen 等[16]鑒定了一種稱為CDR1as(小腦變性相關蛋白1 反義轉錄物,或稱ciRS-7)的circRNA,在其序列上有超過60 個miR-7 結合位點,可吸附miR-7 發揮其“內源性海綿”作用,抑制miR-7 的活性,在斑馬魚實驗中CDR1as 以類似于“敲除miR-7”的方式阻礙了中腦發育[15]。 還有研究發現,轉錄自Y 染色體性別決定區基因的circRNA,包含16 個可結合miR-138 的MRE, 能 夠 負 調 控 miR-138 的 表 達[16]。 目 前circRNA 已被證實在心肌纖維化[17]、糖尿病[18]和類風濕性關節炎[19]等疾病中具有miRNA 分子海綿的功能。

2 ceRNA 調控支氣管哮喘的發生發展

2.1 ceRNA 調控氣道平滑肌細胞增殖

氣道平滑肌細胞(airway smooth muscle cell,ASMC)是呼吸道的重要組成部分,ASMC 過度增生和肥大,會導致氣道增厚和變窄甚至氣道阻塞,故ASMC 在哮喘、 慢性阻塞性肺疾病( chronic obstructive pulmonary disease,COPD)等慢性呼吸道疾病的氣道重塑形成過程中的起關鍵作用。 在病理狀態下,ASMC 由于受到各類細胞因子的刺激,處于細胞活性和增殖能力增加的狀態[20],同時ASMC可以通過釋放多種蛋白酶、各型炎癥因子和趨化因子參與氣道炎癥反應[21]。

目前已有多項研究揭示了相關lncRNA 參與AMSC 的增殖。 Zhang 等[22]發現lncRNA BCYRN1可通過上調瞬時感受器電位通道1 的表達來促進哮喘模型大鼠ASMC 的增殖和遷移。 進一步研究發現卵清蛋白致敏大鼠的AMSC 中lncRNA BCYRN1 表達增加,miR-150 表達降低,且lncRNA BCYRN1 水平與miR-150 負相關,RNA pull-down 實驗證實lncRNA BCYRN1 可與miR-150 特異性結合,促進ASMC 的增殖和遷移,而五味子乙素(Schisandrin B)可逆轉這一過程[23]。 Lin 等[24]發現lncRNA TUG1在哮喘模型大鼠ASMC 中的表達增加,同時伴有miR-590-5p 表達降低,經過表達及敲減實驗證實,lncRNA TUG1 表達與miR-590-5p 呈負相關,lncRNA TUG1 可作為ceRNA 吸附miR-590-5p,調節miR-590-5p 的靶基因成纖維細胞生長因子1(fibroblast growth factor 1,FGF1) 的 表 達 水 平。 過 表 達 的lncRNA TUG1 通 過 lncRNA TUG1/miR-590-5p/FGF1 軸促進ASMC 的增殖和遷移,并抑制ASMC 凋亡。 另一項研究顯示[25],lncRNA GAS5 在哮喘模型大鼠ASMC 中表達水平升高并可促進ASMC 增殖,lncRNA GAS5 能作為miRNA 海綿吸附miR-10a,調節腦源性神經營養因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)的表達。 miR-10a 能直接結合BDNF的3′端UTR 區,抑制BDNF 表達。 過度表達的miR-10a 可使有絲裂原誘導的ASMC 增殖減少50%,而抑制miR-10a 使ASMC 增殖能力增加40%。 敲低lncRNA GAS5 能提高miR-10a 的表達水平并顯著降低其靶基因BDNF 的表達,抑制ASMC 的增殖,敲低lncRNA GAS5 基因的哮喘小鼠氣道反應性明顯降低[26]。

在人來源的ASMC 中同樣存在ceRNA 調控機制。 Perry 等[27]報道在體外用地塞米松和胎牛血清培養人ASMC 后,其mRNA、miRNA 和lncRNA 的表達譜發生改變,有4 種lncRNA(RP11-46A10.4、LINC00883、BCYRN1 和LINC00882)表達上調,推測這些lncRNA 可作為目標miRNA 分子(miR-150、miR-371-5p、miR-940 和miR-1207-5p)的分子海綿發揮調控作用,其中lncRNA BCYRN1 和miR-150 的相互作用關系已在動物模型中被證實。 血小板源性生長因子(platelet-derived growth factor, PDGF)等有絲分裂原通過誘導ASMC 過度增殖,促進哮喘氣道重塑[28]。 Lin 等[29]用PDGF-BB 處理人ASMC后,發現lncRNA MALAT1 表達量增加,并促使ASMC 發生增殖和遷移。 熒光素酶報告實驗證實lncRNA MALAT1 與miR-150 存在靶向結合作用,而miR-150 則靶向翻譯起始因子 4E (eukaryotic translation initiation factor 4E,eIF4E)調節信號蛋白Akt 的磷酸化水平。 敲低lncRNA MALAT1 可通過miR-150/eIF4E 通路抑制ASMC 增殖和遷移。 Liu等[30]發現lncRNA LINC00882 在PDGF 處理的人ASMC 中呈高表達,lncRNA LINC00882 可與miR-3619-5p 結合并負性調節miR-3619-5p 的表達。miR-3619-5p 靶 向β-連 環 蛋 白(β-catenin) 調 節ASMC 的增殖。 敲減lncRNA LINC00882 則顯著地抑制了ASMC 的增殖。 這表明lncRNA LINC00882通過吸附miR-3619-5p 促進ASMC 增殖。

2.2 ceRNA 調控CD4+T 細胞免疫反應

目前認為CD4+T 細胞是哮喘氣道炎癥的重要參與者[31]。 根據表型和功能的不同可將CD4+T 細胞分為輔助性T 細胞(Th 細胞)和調節性T 細胞(Treg 細胞)等。 Th 細胞可進一步細分為Th1 細胞、Th2 細胞和Th17 細胞等亞群,可分泌各型細胞因子參與哮喘發病。

Th2 型細胞因子(如IL-4、IL-5、IL-13 等)在哮喘氣道炎癥中的重要性已被廣泛接受。 研究顯示[32],Th 細胞向Th2 細胞的轉化導致Th1 型和Th2型細胞因子失衡,Th2 細胞過度激活,從而促進哮喘的發生和發展,抑制Th2 型細胞因子釋放或提高Th1/Th2 比值可能有助于緩解哮喘相關炎癥。 一項來自Liang 等[33]的研究納入了772 例哮喘患者和441 例健康對照者。 在哮喘組患者外周血CD4+T 細胞中檢測到高表達的lncRNA MALAT1 和低表達的miR-155。 lncRNA MALAT1 表達水平與Th1/Th2 比值及轉錄因子T-bet/GATA3 比值呈負相關關系,而miR-155 表達水平與Th1/Th2 比值和T-bet/GATA3比值呈正相關。 lncRNA MALAT1 與miR-155 互補結合,負向調控Th2 炎性因子的表達,參與調節Th1/Th2 平衡。

亦有研究報道circRNA 可作為ceRNA 參與哮喘Th2 型炎癥。 Huang 等[34]發現哮喘患者外周血CD4+T 細胞中的circRNA has_circ_0005519 較健康人表達增加,且hsa_circ_0005519 表達水平與hsalet-7a-5p 表達水平負相關,實驗證實hsa_circ_0005519 競爭性結合hsa-let-7a-5p 并促進IL-13 和IL-6 表達,從而影響哮喘發展。 另外,在哮喘患者的外周血單個核細胞中也檢測到hsa_circ_0005519 表達升高。

Th17 細胞是Th0 細胞在TGF-β、IL-6、IL-23 作用下分化產生的表達孤核受體γt(nuclear orphan receptor γt,RORγt)的CD4+T 細胞亞群,Th17 細胞可通過分泌IL-17 等細胞因子發揮強大的促炎作用。 Treg 細胞是具有免疫抑制功能的T 細胞亞群,具有限制T 細胞免疫反應的功能。 在正常機體狀態下,Treg 和Th17 細胞相互拮抗,處于平衡狀態,而Treg/Th17 的失衡在哮喘的發展中起著重要作用[35]。 Qiu 等[36]報道,在人外周血CD4+T 細胞中,lncRNA MEG3 可作為ceRNA 吸附has-miR-17 調節RORγt 表達,從而影響哮喘患者的Treg/Th17 平衡。其研究發現,嚴重哮喘患者CD4+T 細胞中lncRNA MEG3 水平較正常人顯著升高,而miR-17 水平較正常人降低。 lncRNA MEG3 表達水平與Th17 占CD4+T 細胞百分比、IL-17 水平、IL-22 水平及RORγt的mRNA 和蛋白水平正相關。 miR-17 通過靶向RORγt 調節Treg/Th17 比值。 敲低LncRNA MEG3可增加miR-17 的表達水平,并相應地降低RORγt表達水平,從而調控Th17 細胞功能。

2.3 ceRNA 調控巨噬細胞極化

肺巨噬細胞存在于肺泡腔和肺間質中,發揮吞噬呈遞抗原、分泌炎癥介質及參與免疫應答的功能。 巨噬細胞有3 種表型,M1 型巨噬細胞具有促炎作用,M2 型巨噬細胞具有抗炎和免疫調節作用,調節性巨噬細胞(也稱為M2 樣巨噬細胞)可在免疫反應后期限制炎癥進展。 巨噬細胞極化可能與哮喘關系密切,研究發現巨噬細胞的活化以及向M1 表型轉化在哮喘的發展過程中起著重要作用[37]。

Zhong 等[38]報告PM2.5 能誘導巨噬細胞向M1表型轉化,并釋放IL-6、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)等多種促炎因子[39],在暴露于PM2.5 的小鼠肺組織中,885 個lncRNA 分子和142 個circRNA 分子的表達水平發生改變。 其中lncRNA NONMMUT065867, lncRNA NONMMUT064312,lncRNA NONMMUT018123 的表達顯著上調,circRNA CBT15_circR_1011,circRNA mm9_circ_005915 的表達顯著下調,進一步分析顯示這些非編碼RNA 與TNF-α、誘導型一氧化氮合酶(iNOS)、IL-1β、IL-6 等促炎細胞因子和NLRP3 炎性小體相關。

Shang 等[40]對小鼠哮喘模型的研究發現,circRNA mmu_circ_0001359 作為miR-183-5p 的內源性miRNA 海綿,增強了轉錄因子FoxO1 信號介導的M2 樣巨噬細胞活化作用。 體外實驗和在體實驗中均發現富含mmu_circ_0001359 的外泌體通過mmu_circ_000135/miR-183-5p/FoxO1 軸減少M1表型相關的細胞因子(iNOS、TNF-α、IFN-γ)表達,降低炎癥水平并減緩氣道重塑。 這項研究提示,可以利用lncRNA 或circRNA 修飾的外泌體以ceRNA 調控網絡為靶點開發哮喘新型療法。

2.4 ceRNA 調控氣道上皮細胞炎癥反應

氣道上皮細胞作為肺與外界環境接觸的第一道屏障,在維持氣道結構和功能完整性及參與氣道免疫反應中起到重要作用。 應激狀態下的氣道上皮細胞分泌的炎性介質作用于自身、抗原提呈細胞和其他氣道支持細胞等, 參與氣道炎癥的發生。Dai 等[41]發現氣管內滴注脂多糖誘導的炎癥模型大鼠肺組織lncRNA MALAT1 表達量升高,miR-146a表達量下降,在用脂多糖誘導大鼠發生肺部炎癥前注射小干擾RNA 敲減MALAT1 可降低大鼠肺損傷評分和IL-6、TNF-α、IL-1β 的表達,同時miR-146a表達量增加；體外實驗證實,在鼠肺上皮細胞和鼠肺泡巨噬細胞中,lncRNA MALAT1 通過吸附miR-146a 調控炎性細胞因子分泌。 另一項涉及COPD發病機制的研究指出,在經香煙煙氣提取物處理的人支氣管上皮細胞中,lncRNA TUG1 表達升高,lncRNA TUG1 通過特異性結合miR-145-5p 促進雙特異性磷酸酶6 (dual-specificity phosphatase 6,DUSP6)的表達,促進氣道炎癥和氣道重塑[42]。 考慮到氣道上皮細胞在Th2 型免疫反應和氣道黏液細胞化生中的重要作用,推測lncRNA TUG1 在哮喘氣道上皮細胞中也可作為ceRNA 發揮調控作用。

2.5 ceRNA 與糖皮質激素抵抗

臨床上部分哮喘患者給予大劑量糖皮質激素后仍不能得到理想的治療效果,此類哮喘被定義為激素抵抗型哮喘。 ASMC 中的ceRNA 調控機制可能與糖皮質激素抵抗相關。 既往研究發現lncRNA PVT1 在非重癥哮喘患者ASMC 中表達降低,在糖皮質激素抵抗的嚴重哮喘患者中表達升高,且lncRNA PVT1 與ASMC 的增殖和IL-6 合成釋放相關[43]。 Yu 等[44]利用大鼠哮喘模型證實lncRNA PVT1 可作為miR-203a 的分子海綿發揮作用,負向調節miR-203a 表達水平并正向調節其下游轉錄因子E2F3 的表達,從而促進ASMC 的增殖和遷移,而α-細辛腦則通過lncRNA PVT1/miR-203a/E2F3 軸抑制ASMC 的增殖。 另有研究發現lncRNA CASC7可能是與糖皮質激素敏感性相關的轉錄本。 Liu等[45]在嚴重哮喘患者的ASMC 中檢測到低表達的lncRNA CASC7,而miR-21 表達水平升高、Akt 活性上調。 過表達lncRNA CASC7 通過靶向結合miR-21抑制了PI3K/Akt 信號通路,促進糖皮質激素受體磷酸化,從而增加了糖皮質激素的敏感性。

2.6 生物信息學預測哮喘相關的ceRNA

Chen 等[46]通過高通量測序技術獲得了來自非重癥哮喘患者、嚴重哮喘患者和健康人群的mRNA、miRNA 和lncRNA 表達譜數據,初步確定has-miR-133a-3p、has-miR-3613-3p 和has-miR-93-5p 是哮喘病情進展相關的miRNA-mRNA-lncRNA 網絡的關鍵miRNA。 在另一項研究中,Liao 等[47]利用Gene Expression Omnibus、StarBase、DrugBank 等在線數據庫及生物信息學工具構建哮喘相關的ceRNA 網絡,確定了5 個關鍵lncRNA(MALAT1,MIR17HG,CASC2,MAGI2-AS3,DAPK1-IT1),并針對對應的ceRNA 靶點預測了8 種潛在靶向藥(他莫昔芬,魯索替尼,維甲酸,槲皮素,達沙替尼,左卡尼汀,尼氟酸,格列本脲)。 目前利用一些非編碼RNA 數據庫可以預測與哮喘相關的ceRNA 網絡,但是不同的預測算法得到的結果不盡相同,且有關研究涉及的樣本量普遍較少,故這種相關關系仍需要實驗驗證和臨床大樣本的檢驗。

3 ceRNA 與哮喘臨床診療

Li 等[48]利用RT-qPCR 檢測哮喘急性發作患者、緩解期哮喘患者、健康人血漿中lncRNA NEAT1和miRNA-124 的表達,發現哮喘急性發作患者的lncRNA NEAT1 表達量高于另外兩組,且與TNF-α、IL-1 和IL-17 水平及病情嚴重程度呈正相關,與IL-10 水平及肺功能負相關；而miR-124 表達量與致炎因子水平及嚴重程度負相關,與肺功能呈正相關,尤其是在哮喘急性發作患者中。 依據lncRNA NEAT1 與miR-124 的負相關關系,推測lncRNA NEAT1 可能是通過吸附miR-124 來調節基因表達,導致哮喘病情加重。 同樣地,Ye 等[49]發現血漿中lncRNA ANRIL 表達水平與miR-125a 表達水平負相關,lncRNA ANRIL 與miR-125a 比值與炎癥因子(TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17)水平、肺功能及病情嚴重程度相關,且哮喘發作患者的lncRNA ANRIL/miR-125a 比值高于緩解期患者。 可以設想的是,在未來的研究中如能確定哮喘中具有特異性的ceRNA 調控網絡,那么只需檢測其中的非編碼RNA表達水平就可將哮喘患者和其他癥狀類似的非哮喘患者區分開來,這將有助于哮喘早期診斷和干預,以及哮喘疑似病人的明確診斷。

4 總結與展望

目前哮喘中已知的ceRNA 見表1。 隨著核酸功能研究和檢測技術的不斷發展,lncRNA 和circRNA已經成為國內外研究的熱點,但是不可忽視的是,目前在ceRNA 研究領域仍存在一些問題和難點,比如生理條件下單個轉錄本的表達變化不足以抑制miRNA 的活性,只有當ceRNA 的豐度接近于靶miRNA 的豐度時才能抑制miRNA 靶標；實驗中人為操控基因表達容易過量,并不能真實反應體內常態下的ceRNA 作用；由于實驗設計的可行性和實驗條件的限制,ceRNA 直接互作的研究往往局限于單個基因；目前多數研究仍停留在細胞功能研究水平,需要在動物模型和臨床實踐中得到驗證。 此外mRNA 可通過ceRNA 機制隔離miRNA 發揮調控作用,但在哮喘研究領域尚無涉及。

表1 參與支氣管哮喘病理機制的競爭性內源性RNATable 1 ceRNAs involved in the pathogenesis of bronchial asthma

綜上所述,ceRNA 假說的提出拓展了轉錄后水平基因表達調控的機制,對于ceRNA 調控網絡的研究揭示了其在疾病的發生、發展重要作用。 目前的研究已經提示以lncRNA BCYRN1、lncRNA MALAT1等為代表的非編碼RNA 在哮喘中的重要作用,但相較于癌癥研究領域,在支氣管哮喘機制研究中涉及ceRNA 的研究相對較少。 隨著對非編碼RNA 相關研究的深入,越來越多的miRNA、lncRNA、circRNA將被發現可作為評判哮喘病情預后的指標或者治療的靶點。 以ceRNA 調控網絡為靶標的治療策略有望成為治療哮喘的新途徑、新方法。