響應面法優化紫草中總萘醌的提取工藝

鄧 強，程 燁，蘇江濤，柯賢炳

(1 湖北工業大學生物工程與食品學院，湖北 武漢 430068; 2 武漢生物工程學院藥學院，湖北 武漢 430068)

紫草(Arnebiaeuchroma)為紫草科植物新疆紫草或內蒙紫草的干燥根，作為藥物，始載于《神農本草經》[1]。紫草的有效成分主要有兩大類：一類是以萘醌類成分為主的脂溶性成分，另一類是以多糖為主的水溶性成分[2]。其中萘醌類成分具有抗炎、抗腫瘤和免疫調節等作用[3-5]，其提取方法的研究對相關產品的開發和利用具有重要的現實意義。萘醌類成分極性較小，常用的提取溶劑有石油醚、氯仿等有機溶劑和植物油[6-7]。從產品開發的角度考慮，本研究首次選用了橄欖油為提取溶劑。橄欖油是世界公認的優質植物油，含有多種天然生理活性物質[8]，通過提取萘醌類成分制作成的紫草油、紫草膏或潤唇膏等，在中藥化妝品的開發上將有較大的應用前景。

響應面法(Response surface methodology，RSM)是一種常用于優化中藥材提取條件的方法。其運用數學函數進行分析，同時討論各因素之間的相互作用，從而得出最優的實驗條件，具有精度高、預測值精準的優點。本研究采用響應面法優化紫草中總萘醌的提取工藝，為紫草中萘醌類成分的進一步開發、利用提供理論依據。

1 材料

1.1 儀器

粉碎機(吉首市中誠制藥機械廠)；超聲機(濟南巴克超聲波科技有限公司)；離心機(湖南凱達科學儀器有限公司)；UV1800型-紫外分光光度計(上海光譜儀器有限公司)。

1.2 試劑

新疆紫草(湖北辰美中藥有限公司)；左旋紫草素對照品(中國藥品生物制品鑒定所，純度>98%，供鑒別使用)；橄欖油(廣州歐博化妝品有限公司，化妝品級別)；無水乙醇(國藥集團化學試劑有限公司)。

2 方法與結果

2.1 溶液的配制

2.1.1 對照品溶液稱取左旋紫草素對照品2.5 mg于50 mL容量瓶中，用95%乙醇溶解并定容，即得質量分數為0.05 mg/mL的左旋紫草素對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液稱取適量紫草中藥飲片，粉碎過3號篩，得紫草粗品，精密稱取紫草粉末1.0 g，置于100 mL的燒杯中，加入40 mL橄欖油于40 ℃下浸泡4 h，取上述橄欖油1 mL于10 mL容量瓶中加95%乙醇定容，即得。

2.2 線性關系考察

2.2.1 紫草含量檢測波長的選擇精密吸取1 mL左旋紫草素對照品溶液和紫草供試品溶液于不同10 mL量瓶中，用無水乙醇定容，搖勻靜置，以無水乙醇為對照，在200～800 nm波長下掃描，以波長為橫坐標，吸收值為縱坐標。結果表明，溶液吸光度在516 nm波長處較大，故選擇516 nm為檢測波長。紫外-可見光譜圖見圖1。

(a)左旋紫草素對照品

2.2.2 標準曲線的繪制及線性范圍考察分別精密移取2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL左旋紫草素對照品溶液，于10 mL容量瓶中，用無水乙醇定容，搖勻靜置，以無水乙醇為對照，在波長為516 nm處測定其吸光度。以吸光度為縱坐標(y)、濃度為橫坐標(x)，繪制標準曲線。得到左旋紫草素對照品的回歸方程為y=20.96x+0.0292(r2=0.9988)，紫草檢測質量濃度線性范圍為0.01～0.03 mg/mL。

2.3 新疆紫草中總萘醌的含量測定

精密量取上述樣品供試液2 mL，按“2.2.2”項下的操作方法，再計算出樣品中總萘醌的量。

2.4 單因素考察實驗

2.4.1 料液比對總萘醌得率的影響精密稱取1 g紫草粉末，共5份，置錐形瓶中，依次加入10、20、40、60、80 mL的橄欖油，在25℃的條件下，浸泡4 h，每個樣品中取1 mL加入10 mL的無水乙醇超聲3 min，于3000 r/min離心。由圖2可知，隨著橄欖油體積的增加，總萘醌得率先上升后下降，當橄欖油的體積為40 mL時，得率最高，故選擇料液比20、40、60 g/mL為后續優化參考水平。

圖 2 料液比對總萘醌得率的影響

2.4.2 提取時間對總萘醌得率的影響精密稱取1 g紫草粉末，共5份，置錐形瓶中，加入20 mL橄欖油，在25 ℃下分別浸泡1、2、4、6、8 h，在每個樣品中取1 mL加入10 mL的無水乙醇超聲3 min，于3000 r/min離心。由圖3可知，浸泡時間在4 h的時候，總萘醌的得率最高，故選擇2、4、6 h為后續優化參考水平。

圖 3 提取時間總萘醌得率的影響

2.4.3 提取溫度對總萘醌得率的影響精密稱取1 g紫草粉末，共5份，置錐形瓶中，加入20 mL橄欖油，分別在20、40、60、80、100 ℃下浸泡4 h，在每個樣品中取1 mL加入10 mL的無水乙醇超聲3 min，于3000 r/min離心。由圖4可知，隨著提取溫度的升高，總萘醌得率先升高后下降，當溫度為50 ℃時得率達最高，故40、50、60 ℃為后續優化參考水平。

圖 4 提取溫度對總萘醌得率的影響

2.5 Box-Behnken設計-響應面法優化試驗

2.5.1 方案設計及實驗結果根據單因素試驗，綜合考慮影響紫草總萘醌得率的3個因素，即料液比(A)、提取時間(B)和提取溫度(C)，采用Box-Behnken法設計實驗方案，做響應面的優化研究。用-1、0、1分別表示因素的低、中、高三個水平，設計3因素3水平的響應面分析實驗。實驗因素及水平見表1，方案設計及結果見表2。

表1 實驗因素及水平

表2 響應面分析實驗設計與結果

2.5.2 模型的建立及顯著性檢驗采用Design-Expert.10.0.7軟件進行多元回歸擬合分析，以紫草總萘醌含量(Y)為響應值對料液比(A)、提取時間(B)、提取溫度(C)進行多元線性回歸和二次多項式方程擬合，得回歸方程為：

Y=2.30+0.047A-0.071B-6.25×

10-3C+0.013AB-0.038AC-0.06BC-

0.17A2-0.09B2-0.28C2

方差分析結果見表3。

表3 方差分析表

由表3可知，該模型的P<0.01，表明該回歸模型是顯著的，用該模型對紫草中總萘醌的提取工藝進行分析驗證是合理的。失擬項P=0.2990>0.05，說明未知因素對試驗結果的干擾很小，可以利用該模型確定最佳提取工藝條件。

2.5.3 響應面優化圖及分析采用Design-Expert.10.0.7軟件進行分析，得出相應的響應面圖。由圖5三維圖可以發現，當料液比在1∶35～1∶45范圍內時，總萘醌的得率隨溫度的升高逐漸下降；等高線圖呈橢圓形，說明料液比和提取溫度之間的交互作用顯著；圖6等高線圖呈圓形，說明提取時間和料液比之間的交互作用不顯著；由圖7三維圖可以發現，當提取時間一定時，總萘醌的得率隨溫度升高逐漸下降，等高線圖呈橢圓形，說明提取溫度和提取時間之間的交互作用顯著。因此在合適的料液比、提取溫度、提取時間下，紫草中總萘醌的得率會出現極大值。

圖 5 料液比和溫度響應面圖

圖 6 料液比和時間的響應曲面圖

圖 7 時間和溫度的響應曲面圖

2.5.4 驗證實驗通過Design-Expert.10.0.7軟件對模型求解方程，得到最優提取工藝條件，料液比1∶42.49，提取溫度46.05 ℃，提取時間4.04 h，在該條件下總萘醌含量達到最大值2.32%。為便于實際操作，將總萘醌的提取工藝調整如下，料液比1∶42，提取溫度46 ℃，提取時間4 h。在此條件下平行進行3次驗證試驗，得率分別為2.22%、2.31%和2.25%，測得總萘醌平均得率2.26%，與模型預測值2.32%接近，表明該工藝條件穩定、可靠，同時也說明建立的回歸模型合理。

3 討論與結論

本研究采用Box-Behnken響應面法優化紫草中總萘醌的提取工藝。研究表明，隨著溫度的升高或浸泡時間的延長，紫草中總萘醌得率都呈現先升高后下降的趨勢，推測其可能是紫草中蒽醌類結構不穩定導致。有報道稱，紫草素具有光不穩定性，萘醌類結構中的羥基也使紫草素易被氧化[9-10]。本研究首次采用橄欖油作為提取溶劑。橄欖油是一種安全的食用油且含有多種天然的生理活性物質，如VE、VK和類胡蘿卜素等[11]，在開發一些中藥應用產品時具有協同或增效的價值，并且本研究在紫草中總萘醌的提取上，采用橄欖油浸泡提取法，其操作簡單，得率較高，具有實際應用價值。

綜上所述，本研究采用橄欖油作為溶劑，通過Box-Behnken設計-響應面法成功優化了紫草中總萘醌的提取工藝,優化后的提取工藝合理可行。