槲皮素對糖尿病腎病大血管病變大鼠體內(nèi)TGF-β1、MT-1和α-SMA水平的影響

李軍，賈永康，張秋艷，符宇

（1.河南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450000；2.鄭州人民醫(yī)院，河南 鄭州 450003；3.鄭州市骨科醫(yī)院，河南 鄭州 450003；4.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450046）

近年來，隨著我國的高速發(fā)展，國民的經(jīng)濟水平逐漸提高，人們的生活質(zhì)量也不斷改善，同時也導(dǎo)致糖尿病的患病人數(shù)逐年增長。糖尿病腎病患者發(fā)病早期會導(dǎo)致腎小球萎縮，且濾過率也會出現(xiàn)異常，此異常是導(dǎo)致患者出現(xiàn)大血管病變的主要危險因素［1］，大血管病變則會導(dǎo)致腦炎與心血管疾病等［2］。糖尿病腎病會影響腎臟的正常工作，晚期時會引發(fā)腎衰竭，使腎功能無法發(fā)揮正常作用，而心血管疾病則是導(dǎo)致腎衰竭患者死亡的重要發(fā)病機制［3］。相關(guān)研究表明，糖尿病腎病引發(fā)心血管疾病的患者會出現(xiàn)高血壓、貧血等癥狀，且會使炎性因子的表達升高，使患者的炎癥情況加重［4］。糖尿病腎病大血管病變是一種較為嚴(yán)重的疾病，治療時多用西藥，其藥效較快，有較為明顯的效果，但西藥會產(chǎn)生一定的不良反應(yīng)，給患者在治療過程中增加了不必要的困擾。中醫(yī)學(xué)對于糖尿病腎病的認(rèn)知有著較多的歷史經(jīng)驗，認(rèn)為“消渴病腎病”主要發(fā)生的原因是“氣”消耗過多傷到了“陰”，以致腎氣血虛弱，較常出現(xiàn)的癥狀為氣短、無力、腰膝酸軟等。槲皮素屬于黃酮醇類化合物，具有抗炎作用，能抑制患者體內(nèi)炎癥因子，使患者的免疫力得到增強，槲皮素對腎臟有一定的保護作用，但其對糖尿病腎病大血管病變的作用機制研究較少［5］。本研究通過建立動物模型，探討槲皮素對于糖尿病腎病大血管病變大鼠治療作用以及對于TGF-β1、MT-1和α-SMA水平的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物與分組

選取健康大鼠40 只（遼寧長生生物公司），大鼠5～6 周齡，體質(zhì)量212～235 g。飼養(yǎng)實驗室溫度23.5～27.3 ℃，相對濕度52%～62%，正常光照，常規(guī)喂養(yǎng)1周后開始實驗。將大鼠隨機分為4組，其中正常組（TT 組）10 只、模型組（JJ 組）10 只、槲皮素低劑量組（DH 組）10只給予50 mg/（kg·d）槲皮素干預(yù)、槲皮素高劑量組（GH組）10只給予100 mg/（kg·d）槲皮素干預(yù)。

1.2 實驗試劑與器械

鏈脲佐菌素STZ（寶雞市辰光生物公司）；槲皮素（河南萊爾茵生物公司）；TGF-β1試劑盒（武漢純度生物公司）；MT-1試劑盒（濟南千司生物公司）；α-SMA試劑盒（濟南千司生物公司）；全自動生化分析儀（濟南千司生物公司）；水合氯醛（佛山信航生物公司）；GSH試劑盒（上海研謹(jǐn)生物公司）；IL-6 試劑盒（泉州市九邦生物公司）。

1.3 模型建立

TT 組大鼠給予正常飲食；其余各組大鼠給予高糖、高脂飲食飼養(yǎng)8 周后，禁食1 d。JJ 組、DH 組及GH組大鼠腹部注射2% STZ，每日注射量60 mg/kg；TT 組大鼠注射同等劑量生理鹽水，3 d后，測量血糖濃度，當(dāng)血糖濃度≥16.7 mmol/L，尿蛋白＞30 mg/L 時，視為糖尿病腎病成功建模。檢查其胸主動脈弓的病理變化，若其主動脈血管內(nèi)皮細胞損傷嚴(yán)重，且其與內(nèi)彈力板連接處間隙擴大，則證明糖尿病腎病大血管病變模型建模成功。DH 組與GH 組用槲皮素溶液灌胃，每日1次，共7次。

1.4 檢測指標(biāo)

1.4.1 血壓

運用ZH-HX-Z 型無創(chuàng)傷血壓測定儀測定大鼠舒張壓（DBP）、平均血壓（MBP）和收縮壓（SBP）。

1.4.2 甘油三酯、尿素氮、總膽固醇水平

各組大鼠禁食12 h 后，于清晨尾部靜脈多次取血共2 mL，然后以2 500 r/min的速度離心10 min，取上清液，用全自動生化分析儀檢測大鼠甘油三酯、尿素氮、總膽固醇水平。

1.4.3 血清中GSH、IL-6的含量

以10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，取頸部動脈血，以2 500 r/min 的速度離心10 min，取上清液。按照GSH、IL-6試劑盒方法檢測GSH與IL-6水平。

1.4.4 腎組織的病理變化

治療結(jié)束后，麻醉處死大鼠，取各組大鼠腎組織，經(jīng)甲醛固定24 h 后酒精脫水。二甲苯透明浸蠟后，常規(guī)切片，HE染色后用顯微鏡觀察。

1.4.5 Western Blot 法檢測TGF-β1、MT-1 和α-SMA蛋白情況

取大鼠主動脈標(biāo)本，將血管剪碎后置勻漿套管中，加入1 mL 裂解液進行裂解并提取蛋白，并對蛋白的濃度進行測量，分裝后，保存在-20 ℃的環(huán)境中。將提取出的蛋白溶液和緩沖溶液按4∶1 的比例進行混勻，為了讓蛋白質(zhì)變性需將蛋白溶液全部進行煮沸處置。把電泳后的50 μg蛋白樣品轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，加脫脂奶粉封閉1 h。加入一抗后使用TTBS 漂洗3 次，每次漂洗10 min，最后加入二抗對溶液進行稀釋，常溫封閉1 h。取出PVDF 膜，漂洗3 次，每次間隔10 min，DAB顯色后照相。嚴(yán)格按照TGF-β1、MT-1 和α-SMA試劑盒說明操作，計算其蛋白表達含量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS17.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析。大鼠α-SMA、TGF-β1 和MT-1 蛋白表達等指標(biāo)采用方差分析，不同組之間比較采用t檢驗，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血壓比較

JJ 組大鼠DBP、SBP、MBP 高于TT 組（P＜0.05）；DH 組、GH 組大鼠血壓較JJ 組明顯降低（P＜0.05）；GH 組大鼠DBP、SBP、MBP 血壓值低于DH 組（P＜0.05）。說明槲皮素可降低糖尿病腎病大血管病變大鼠血壓，且隨著槲皮素劑量的增加血壓降低越明顯。見表1和圖1。

表1 各組大鼠血壓檢測結(jié)果比較（±s，mm Hg）

表1 各組大鼠血壓檢測結(jié)果比較（±s，mm Hg）

注：與TT 組比較，*P＜0.05；與JJ組比較，#P＜0.05；與DH 組比較，@P＜0.05。

MBP 93.25±4.57 141.11±11.24*129.38±6.37*#95.17±5.26*#@108.60＜0.001組別TT組JJ組DH組GH組F值P值n 10 10 10 10 DBP 81.36±5.67 127.32±9.24*112.73±6.59*#88.61±4.13*#@101.90＜0.001 SBP 112.21±11.53 162.21±13.67*145.54±5.37*#115.39±7.14*#@58.39＜0.001

圖1 各組大鼠血壓檢測結(jié)果比較

2.2 各組大鼠血清甘油三酯、尿素氮和總膽固醇水平比較

JJ組大鼠血清中甘油三酯、尿素氮和總膽固醇水平高于TT組（P＜0.05）；與JJ組相比，DH組、GH組大鼠血清中甘油三酯、尿素氮和總膽固醇水平降低（P＜0.05）；GH組大鼠血清中甘油三酯、尿素氮和總膽固醇水平明顯低于DH組（P＜0.05）。說明槲皮素可降低糖尿病腎病大血管病變大鼠血清中甘油三酯、尿素氮和總膽固醇水平，且劑量越大效果越明顯。見表2和圖2。

表2 各組大鼠甘油三酯、尿素氮和總膽固醇表達水平比較（±s，mmol/L）

表2 各組大鼠甘油三酯、尿素氮和總膽固醇表達水平比較（±s，mmol/L）

注：與TT 組比較，*P＜0.05；與JJ組比較，#P＜0.05；與DH 組比較，@P＜0.05。

總膽固醇3.68±0.35 6.74±0.13*4.22±0.07*#3.32±0.08*#@633.50＜0.001組別TT組JJ組DH組GH組F值P值n 10 10 10 10甘油三酯1.15±0.13 3.27±0.14*1.72±0.07*#1.32±0.04*#@869.20＜0.001尿素氮3.89±0.14 8.16±0.13*4.61±0.32*#4.25±0.21*#@854.30＜0.001

圖2 各組大鼠甘油三酯、總膽固醇和尿素氮表達水平比較

2.3 各組大鼠血清中GSH、IL-6的表達比較

與TT 組相比，JJ 組大鼠血清中GSH 水平降低，IL-6 水平升高（P＜0.05），與JJ 組相比，DH 組、GH 組大鼠血清中GSH 水平升高，IL-6 水平降低（P＜0.05）；GH組GSH水平高于DH組（P＜0.05），IL-6水平低于DH 組（P＜0.05）。說明槲皮素可影響GSH、IL-6 水平，且隨著劑量的增加各組大鼠血清中GSH、IL-6表達水平改善越明顯。見表3和圖3。

圖3 各組大鼠血清中GSH、IL-6水平比較

表3 各組大鼠血清中GSH、IL-6的表達比較（±s）

表3 各組大鼠血清中GSH、IL-6的表達比較（±s）

注：與TT 組比較，*P＜0.05；與JJ組比較，#P＜0.05；與DH 組比較，@P＜0.05。

IL-6（ng/L）63.21±7.42 91.71±11.86*73.25±7.57*#67.41±7.12*#@20.81＜0.001組別TT組JJ組DH組GH組F值P值n 10 10 10 10 GSH（mmol/L）19.75±1.28 12.53±4.27*17.05±3.26*#18.82±2.37*#@12.34＜0.001

2.4 HE染色觀察大鼠腎組織的病理變化

TT 組的腎組織的細胞排列有序，腎小球內(nèi)的細胞數(shù)量正常；JJ組腎組織細胞排序較為混亂，其腎小球內(nèi)的細胞發(fā)生改變，數(shù)量減少；DH 組與GH 組腎組織內(nèi)的細胞有序排列且其腎小球內(nèi)的細胞數(shù)量均較JJ 組有所增加，GH組效果更優(yōu)。見圖4。

圖4 大鼠腎組織病理變化（HE染色，×400）

2.5 各組大鼠主動脈樣本中α-SMA、TGF-β1 和MT-1蛋白表達比較

JJ 組大鼠主動脈樣本中α-SMA、TGF-β1 和MT-1蛋白表達皆高于TT組（P＜0.05）；與JJ組相比，DH 組、GH 組大鼠上述蛋白均顯著降低（P＜0.05）；DH 組大鼠主動脈樣本中α-SMA、TGF-β1 和MT-1蛋白表達高于GH 組（P＜0.05）。說明高劑量的槲皮素可有效抑制α-SMA、TGF-β1 和MT-1 蛋白表達。見表4和圖5。

圖5 各組大鼠主動脈樣本中α-SMA、TGF-β1、MT-1蛋白表達比較

表4 各組大鼠α-SMA、TGF-β1和MT-1水平比較（±s）

表4 各組大鼠α-SMA、TGF-β1和MT-1水平比較（±s）

注：與TT 組比較，*P＜0.05；與JJ組比較，#P＜0.05；與DH 組比較，@P＜0.05。

MT-1 3.68±0.35 6.74±0.13*4.22±0.07*#3.32±0.08*#@950.30＜0.001組別TT組JJ組DH組GH組F值P值n 10 10 10 10 α-SMA 1.15±0.13 3.27±0.14*1.72±0.07*#1.32±0.04*#@1 304.00＜0.001 TGF-β1 3.89±0.14 8.16±0.13*4.61±0.32*#4.25±0.21*#@1 281.00＜0.001

3 討論

隨著糖尿病的發(fā)生，其帶來的并發(fā)癥也隨之增加，糖尿病腎病大血管病變就是其中的一種。糖尿病腎病大血管病變的發(fā)病時間較長，過程較為緩慢，主要是由于糖尿病患者代謝紊亂使血管以及血管內(nèi)皮細胞內(nèi)的超氧化物生長過多，ROS 在細胞內(nèi)快速增加阻礙血管的生成，血管出現(xiàn)缺血等現(xiàn)象，這使得患者體內(nèi)炎性因子增加，令患者體內(nèi)的炎癥加重。新血管生成的紊亂則會使患者的毛細血管變得通透，從而出現(xiàn)斑塊破裂等現(xiàn)象，加重患者病情［6-9］。糖尿病腎病的主要病因為患者病情加重傷及腎臟，使腎臟不能正常工作，且患者由于糖尿病的加重還會引起血糖、血脂等的紊亂。引發(fā)糖尿病腎病大血管病變的原因多樣，不僅與炎癥增加有直接關(guān)系，與蛋白質(zhì)非酶糖基化等也有密切聯(lián)系［10］。其大血管病變涉及主動脈、肌性動脈等，最為熟知的是動脈粥樣硬化發(fā)病率在糖尿病患者中高出數(shù)倍，也是由于糖尿病腎病患者的大血管病變產(chǎn)生的。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，中藥可以對糖尿病腎病患者的治療帶來一定的療效［11-13］。

根據(jù)本研究發(fā)現(xiàn)，JJ組大鼠血清中甘油三酯、尿素氮、總膽固醇、血壓及IL-6均高于TT組；與JJ組相比，DH 組、GH 組甘油三酯、尿素氮、總膽固醇、血壓及IL-6均有所降低，且給予高劑量槲皮素干預(yù)的大鼠體內(nèi)甘油三酯、尿素氮、總膽固醇、血壓及IL-6 水平改善優(yōu)于低劑量槲皮素，說明槲皮素可對IL-6 產(chǎn)生抑制作用。膽固醇是合成腎上腺皮質(zhì)激素、性激素等維持正常生理生活的重要物質(zhì)，也是構(gòu)成細胞膜的主要成分，其升高會導(dǎo)致粥動脈硬化、糖尿病和腎病綜合征等。甘油三酯過高會導(dǎo)致血液中的脂質(zhì)含量過高，血液的黏稠物質(zhì)在血管壁內(nèi)沉淀形成塊狀，引發(fā)動脈粥硬化；在腎臟表達過多則會使腎臟受損，嚴(yán)重會導(dǎo)致腎衰竭。尿素氮的敏感性較差，在腎小球濾過率降低到50%以下時就會出現(xiàn)，尿素氮的增加會引起腎臟缺血、血容量不足、急性腎炎、脫水、消化道出血等。腎臟是血液供應(yīng)最豐富的一個器官，長期承受高血壓會使腎臟血管變硬或變細，進而使腎臟發(fā)生萎縮。IL-6是一種多效的細胞因子，它可以使胰島B細胞受到損傷，并降低其功能，誘導(dǎo)機體產(chǎn)生胰島素抵抗；還可以損傷腎小球，產(chǎn)生尿蛋白［14］。過高的尿蛋白會使腎小球重吸收的負(fù)擔(dān)加重，導(dǎo)致腎小管萎縮，產(chǎn)生高脂血癥。GSH在人體的每個細胞中都有體現(xiàn)，是一種活性肽，可調(diào)節(jié)人體的免疫功能。徐麗娜等［15］研究證實，給予不同劑量的槲皮素對子宮內(nèi)膜細胞損傷模型大鼠進行干預(yù)，結(jié)果表明隨著槲皮素濃度的升高，大鼠體內(nèi)IL-6 等炎性物質(zhì)水平明顯降低。楊曉琳等［16］通過實驗發(fā)現(xiàn)，槲皮素具有降低血糖、抗氧化應(yīng)激、抗炎和抑制腎臟纖維化等作用機制，能夠?qū)δI臟起到保護作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，JJ 組大鼠主動脈樣本中α-SMA、TGF-β1 和MT-1 蛋白表達皆高于TT 組（P＜0.05）；與JJ 組相比，DH 組、GH 組大鼠上述蛋白均顯著降低；DH 組大鼠主動脈樣本中α-SMA、TGF-β1 和MT-1蛋白表達高于GH 組。說明高劑量的槲皮素能有效地抑制α-SMA、TGF-β1 和MT-1 蛋白表達。α-SMA的異常表達會引起血管鈣化，血管鈣化是腎衰竭晚期患者的并發(fā)癥。糖尿病的主要并發(fā)癥是血管壁纖維化，血管壁纖維化主要表現(xiàn)為血管管腔直徑縮小，動脈壁加厚。TGF-β1 可促進成纖維細胞的增殖，可通過消除纖維化發(fā)展過程中病變組織產(chǎn)生過多的TGF-β1進行血管壁纖維化的治療。MT-1可降低動脈粥樣硬化的病變程度并保護血管免于受到損傷。高血糖會使蛋白糖基化增加并在人體組織中堆積，從而通過改變腎小球基底膜的組織結(jié)構(gòu)等使腎小球硬化，使腎臟受到損傷出現(xiàn)功能紊亂，難以正常工作，腎臟受損后其腎組織內(nèi)α-SMA、TGF-β1 和MT-1 的蛋白表達較正常腎組織中的表達升高，這使得腎小球濾過率增加，成纖維細胞的增長加快，從而加重腎功能的損傷［17］。α-SMA 可反映平滑肌細胞的數(shù)量及其收縮能力。TGF-β1 是導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化的重要因素，其主要作用機制為增加腎小球系膜區(qū)細胞外基質(zhì)的合成、積聚，導(dǎo)致腎小球硬化，腎功能衰竭。槲皮素干預(yù)后可使糖尿病腎病大血管病變大鼠體內(nèi)TGF-β1、MT-1和α-SMA 蛋白的表達量降低［18］。KIMURA 等［19］研究表明，α-SMA、MT-1 和TGF-β1 在糖尿病腎病患者中表達過高。戶慶峰等［20］研究表明，槲皮素可能通過下調(diào)TGF-β1、MCP-1 的表達改善系統(tǒng)性紅斑狼瘡小鼠腎功能。槲皮素可通過抑制超氧陰離子發(fā)生反應(yīng)，抑制自由基產(chǎn)生，阻礙其參與促糖化過程，具有較強的抗氧化作用［21］。也有研究發(fā)現(xiàn)槲皮素可參與糖化，和氧化熒光產(chǎn)物之間存在密切相關(guān)聯(lián)系，改善血管病變主要與可抑制TGF-β1、AGEs 和MDA有關(guān)［22］。

綜上所述，槲皮素對于糖尿病腎病大血管病變大鼠有一定正向促進作用，其作用機制與降低α-SMA、MT-1指標(biāo)和改善炎性水平有關(guān)。