頭頸鱗癌預后相關差異表達LncRNAs 的篩選、ceRNA網(wǎng)絡構建及生物學功能預測

吳麗芷，申麗君，黃茂凌，祁承林，楊蕊，盛建飛，陳始明

武漢大學人民醫(yī)院，武漢430060

頭頸鱗癌（HNSCC）主要由舌癌、口腔癌、喉癌及鼻咽癌組成，是頭頸部最常見的惡性腫瘤［1］。目前大多數(shù)HNSCC 患者的臨床結局及長期生存率仍不高，5 年生存率為50%～60%［2］。因此，深入了解HNSCC 發(fā)生的分子機制并開辟特異的靶向治療具有十分重要意義。長鏈非編碼RNA（LncRNAs）是指長度超過200 個核苷酸的RNA 轉錄本，其不具備蛋白編碼的潛力。隨著高通量測序技術的發(fā)展，LncRNAs與包括惡性腫瘤在內的眾多疾病的發(fā)病關系逐漸被認識［3］。越來越多的證據(jù)表明，LncRNAs在癌癥的發(fā)生和發(fā)展中起著關鍵作用，如lncRNA BANCR在胃癌中高表達并與患者低生存率相關［4］。

近年研究表明，與其他惡性腫瘤相似，LncRNA和microRNAs（miRNAs）之間的相互作用也發(fā)生在HNSCC 中，并且其下游的一些靶基因已被證實與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關。根據(jù)競爭性內源性RNA（ceRNA）假說［5］，ceRNAs 通過競爭相同的miRNAs 響應元件［6］與mRNAs 進行通信。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，LncRNAs 作為ceRNAs 在HNSCC 的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用［7］。2005年啟動的癌癥基因組圖譜（TCGA）項目已經(jīng)生成33 種癌癥關鍵基因組變化的全面、多維的圖譜，收集了11 000多例患者的相關臨床數(shù)據(jù)。為數(shù)據(jù)挖掘和潛在生物標志物的識別提供了豐富的資源［8］。目前，LncRNA 與HNSCC的關系仍無定論。

本研究利用TCGA 中HNSCC 患者LncRNAs 測序數(shù)據(jù)，篩選出HNSCC 組織與對照組織中差異LncRNAs，并選出了有診斷價值且未被報道過的候選LncRNA，同時以候選LncRNA 為中心構建了ceRNA調控網(wǎng)絡，并預測了其生物學功能。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源 TCGA 數(shù)據(jù)庫（https：//cancerge?nome.nih.gov/）；STRING 數(shù)據(jù)庫（http：//string-db.org/cgi/input.pl）；David數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/）；Kaplan-Meier 數(shù)據(jù)庫（http：//kmplot.com/anal?ysis/）。

1.2 HNSCC 組織中候選LncRNA 篩選及其與患者預后關系的驗證 從TCGA 數(shù)據(jù)庫下載HNSCC Ln?cRNA 數(shù)據(jù)及臨床信息。數(shù)據(jù)庫中收錄502 例份HNSCC 組織樣本和44 例份鄰近正常組織樣本。使用R 語言“degeR”包根據(jù)P<0.05 和|log2FC|>1.0 篩選HNSCC 組織及正常組織樣本中差異的LncRNA，即為差異表達基因（DEGs），鑒別差異表達LncRNAs的詳細步驟參考Sui 等［9］的研究報道。利用Kaplan-Meier Plotter 數(shù)據(jù)庫對差異表達LncRNAs 生存分布進行可視化，選出有診斷價值潛力的候選Ln?cRNAs。基于TCGA-HNSCC 數(shù)據(jù)集，比較正常組織與HNSCC 組織候選LncRNAs 的差異以及候選Ln?cRNAs 高、低表達者的生存時間差異。采用接受者—操作特征（ROC）曲線下面積評估LncRNAs對HN?SCC 的診斷價值（1 表示完全判別值，0.5 或更少表示無判別值）。

1.3 候選LncRNA 的ceRNA 網(wǎng)絡構建 通過star?Base v3.0 篩選出與HOXA11-AS 相關的miRNAs，之后在oncomir 在線軟件上查找出差異miRNAs，通過對比找出HOXA11-AS相關的差異miRNAs。再次通過starBase v3.0 按照：Sites≥5，CancerNum≥10 的條件篩選出miRNAs 相關的mRNAs，而后又通過on?comir 篩選miRNAs 相關的mRNAs。最后利用Cyto?scape v3.5.1繪制HOXA11-AS介導的ceRNA網(wǎng)絡。

1.4 候選LncRNA 的生物學功能分析 使用DA?VID 數(shù)據(jù)庫對候選LncRNA 進行基因本體功能（GO）和KEGG 通路分析，顯著性水平P<0.05，富集分數(shù)>1.5［9］。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS22.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，比較采用單因素方差分析，進一步組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 HNSCC 組織中候選LncRNA 及其與患者預后關系的驗證 篩選出HNSCC 組織與正常組織差異表達的LncRNAs 有129 個，其中65 個下調表達，64個上調表達。Kaplan-Meier Plotter 在線網(wǎng)站對候選的差異表達LncRNAs 生存分布進行可視化結果顯示，14 個上調表達、11 個下調表達的LncRNAs 患者生存曲線差異有統(tǒng)計學意義，最后篩選出較有潛力且未被報道的LncRNA HOXA11-AS 作為候選Ln?cRNA。

基于TCGA-HNSCC 數(shù)據(jù)集，與相鄰正常組織相比，HNSCC 組織中HOXA11-AS 的表達水平均升高（P<0.05）（圖1），HOXA11-AS 的ROC 曲線下面積（AUC）為0.9031。與HOXA11-AS低表達HNSCC 患者比較，HOXA11-AS 高表達HNSCC 患者的生存時間更短（n=499，P=0.011<0.05）（圖2）。

圖1 基于TCGA數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)HNSCC組織及癌旁組織中HOXA11-AS的表達水平

圖2 HOXA11-AS高、低表達者的生存曲線比較

2.2 HOXA11-AS-miRNA-mRNA 網(wǎng)絡 找出4 個HOXA11-AS 相關的差異miRNAs（hsa-miR-130b-3p、hsa-miR-301a-3p、hsa-miR-301b和hsa-miR-454-3p），4 個miRNAs 相關的mRNAs 有9 個下調（AC?SL1、FYCO1、CPEB4、CPEB3、KAT2B、SASH1、PRUNE2、NCOA4、PDLIM3）和3 個 上 調（PML、ANKRD29、EDIL4））。HOXA11-AS介導的ceRNA網(wǎng)絡見圖3。

2.3 HOXA11-AS 的生物學功能 HOXA11-AS 主要參與的生物學功能為細胞對各種生物刺激的反應，包括細胞對內源性刺激的反應、對信使核糖核酸蛋白復合物和細胞質翻譯的負調控等。KEGG通路共有15條，主要涉及背腹軸形成和孕酮介導的卵母細胞成熟等與生殖相關的通路、脂肪代謝相關通路和癌癥相關通路（P<0.05）。

3 討論

圖3 HOXA11-AS介導的ceRNA調控網(wǎng)絡

HNSCC 的發(fā)生發(fā)展是癌基因和抑癌基因共同作用的結果，其機制復雜，目前尚缺乏有效實用的分子標志［10，11］。近年來，包括LncRNAs 和miRNAs 在內已陸續(xù)有多個分子標志物被報道與HNSCC 有關［12］。其中研究最廣泛的LncRNAs 有RHPN1-AS1、WWTR1-AS1 和HOTAIR［13-15］。它們參與了許多重要的細胞過程，如增殖、凋亡、侵襲、轉移等。例如，RHPN1-AS1 在HSNCC 患者中顯著高表達，敲低RHPN1-AS1 可抑制HNSCC 中腫瘤細胞的增殖和侵襲轉移能力［13］。

本研究通過分析TCGA 數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)HOXA11-AS 在HNSCC 中顯著高表達，且其表達與患者的預后呈明顯的負相關，初步提示其為致癌因素。HOXA11-AS 在惡性腫瘤中異常表達及其可能的作用已引起了學者們的關注。GUO 等［16］發(fā)現(xiàn)，肝細胞癌干細胞中HOXA11-AS 高表達；抑制HOXA11-AS表達可抑制其在體內的自我更新、增殖、遷移和致瘤性。BAI 等［17］發(fā) 現(xiàn)，在 非 小 細 胞 肺 癌 組 織 中HOXA11-AS 表達明顯上調，抑制HOXA11-AS 可通過增加miR-148a-3p 的表達來抑制肺癌細胞的增殖并促進癌細胞凋亡。LIU 等［18］則證實HOXA11-AS的上調與胃癌腫瘤大小、TNM 分期和淋巴結轉移呈正相關，HOXA11-AS 通過SRSF1來提高胃癌細胞的增殖和侵襲能力。

雖然HOXA11-AS 與其他腫瘤的發(fā)病特別是某些腺癌發(fā)生的關系已有大致了解，但它如何影響HNSCC 的發(fā)生尚不清楚。越來越多的研究表明Ln?cRNAs 參與了ceRNA 網(wǎng)絡調控，并且LncRNAs 可作為miRNA 誘餌調控基因表達。不同類型的惡性腫瘤，如直腸癌［19］、乳腺癌［20］，都建立了相應的ceRNA網(wǎng)絡模型。鑒于此，本研究按照特定標準構建了HOXA11-AS 介導的HOXA11-AS - DEmiRNAs -DEmRNAs ceRNA 網(wǎng)絡，從理論上探討HOXA11-AS影響HNSCC 發(fā)生的可能途徑。本研究發(fā)現(xiàn)，HOXA11-AS 可 直 接 作 用 于4 個DEmiRNAs（hsamiR-130b-3p，hsa-miR-301a-3p，hsa-miR-301b，hsamiR-454-3p），通 過DEmiRNAs 間 接 作 用 于12 個DEmRNAs。miR-130b-3p 可通過 直 接靶向Notch 配體Delta-like 1（DLL1）來抑制乳腺癌細胞的侵襲和轉移。hsa-miR-301a-3p 可促進結直腸癌的生長及肝轉移，其靶基因為DLC-1 和RUNX3。目前hsamiR-301b 和hsa-miR-454-3p 與腫瘤關系的報道尚少；尚未發(fā)現(xiàn)這四種DEmiRNAs 與HNSCC 相關的報道。因此，本研究發(fā)現(xiàn)的這4 個DEmiRNAs 與HN?SCC的發(fā)病關系值得深入探討。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，HOXA11-AS 的生物學功能主要有細胞對各種生物刺激的反應（細胞對內源性刺激的反應、對信使核糖核酸蛋白復合物和細胞質翻譯的負調控），相關的通路主要有背腹軸形成、孕酮介導的卵母細胞成熟、脂肪酸生物合成和癌癥相關通路。

總之，本研究成功篩選出了HNSCC 預后相關的LncRNA（HOXA11-AS），構建了HOXA11-AS 介導的ceRNA調控網(wǎng)絡；并發(fā)現(xiàn)HOXA11-AS主要參與細胞對各種生物刺激的反應等生物學功能，涉及的信號通路主要有背腹軸形成和孕酮介導的卵母細胞成熟等與生殖相關的通路、脂肪代謝相關通路和癌癥相關通路等。