淫羊藿素對人肺腺癌細胞誘導破骨細胞前體細胞向破骨細胞分化的影響及機制

趙雪強，蔣碧佳，銀建華，盧春蘭，林云

桂林醫學院第二附屬醫院，桂林541199

在各種常見惡性腫瘤中，肺癌的發病率和病死率一直居高不下。盡管隨著手術、化療、分子靶向治療及放療等綜合治療后患者的中位生存期較前明顯延長，但肺癌骨轉移的發生率也隨之增高，有30%～40%的患者發生骨轉移及骨痛、病理性骨折、高鈣血癥等骨相關事件，嚴重影響患者的生活質量和生存期［1］。目前肺癌是影響我國居民健康的首要惡性腫瘤，發病率和病死率呈逐年上升趨勢，治療負擔日益加重，需采用積極有效的防治措施。肺癌骨轉移臨床大多表現為溶骨性改變，主要是過度激活的破骨細胞（OC）導致骨吸收。因此，抑制OC 分化是治療肺癌骨轉移的關鍵［2］。研究表明，中藥可通過促進成骨細胞生成和抑制OC 的分化調節骨代謝［3］。淫羊藿及其衍生物具有調節免疫及內分泌、抗腫瘤、抗骨質疏松等藥理作用［4］。陳琛［5］研究發現，淫羊藿可減輕乳腺癌骨轉移所引發的溶骨性骨質受損和骨痛，其作用機制可能為抑制過度激活的OC，但其分子機制仍不明確。基于此，2019 年8 月—2020 年4月我們觀察了淫羊藿素對人肺腺癌A549細胞與OC前體細胞RAW264.7 共培養后OC 分化、凋亡的影響，并探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 人肺腺癌細胞株（A549 細胞）及OC 前體細胞（RAW264.7 細胞，中科院昆明細胞庫），淫羊藿素（99%以上純度，上海陶素生化科技有限公司），核因子κB 受體活化因子配體（RANKL，95%以上純度，北京義翹神州科技股份有限公司），胎牛血清（FBS）、DMEM 培養液（美國賽默飛世爾科技公司），MTT（美國 AMEROCO 公司），TRIzol、AMV第一鏈cDNA 合成試劑盒［天根生化科技（北京）有限公司］，PCR System（美國賽默飛世爾科技公司），鼠抗腺苷酸活化的蛋白激酶（AMPK）、磷酸化腺苷酸活化的蛋白激酶（p-AMPK，英國abcam 公司），細胞裂解液、苯甲基磺酰氟（PMSF，碧云天生物技術有限公司），β-actin 一抗、辣根過氧化物酶體標記山羊抗小鼠IgG（北京中杉金橋生物技術有限公司），0.4 μm PVDF 膜（美國Millipore 公司），BCA 蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE 電泳液、Western blotting 轉膜液（碧云天生物技術有限公司），DAB 辣根過氧化物酶顯色試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司）。

1.2 細胞培養 將A549細胞及RAW264.7細胞分別接種于含10% FBS 的DMEM 培養液中，在37 ℃、5%CO2、飽和濕度下培養，2～3 d傳代1次，待細胞生長至對數生長期用于后續實驗。

1.3 淫羊藿素對RAW264.7細胞、A549細胞活力的影響 將生長活力良好的RAW264.7細胞按每孔400個加入96孔板，待細胞貼壁后分為對照組、0.1 μmol/L淫羊藿素組、1 μmol/L 淫羊藿素組、10 μmol/L 淫羊藿素組和100 μmol/L 淫羊藿素組，分別加入0、0.1、1、10、100 μmol/L 的淫羊藿素，每濃度設 3 個復孔，同時設空白對照（僅加培養液），分別干預24、48、72 h后，每孔加5 mg/mL的MTT 20 μL，繼續培養4 h，棄掉培養液，每孔加DMSO 200 μL，振蕩5 min，使沉淀充分溶解。用酶標儀測490 nm 波長處的吸光度（A）值。同時設置調零孔（培養基、MTT、二甲基亞砜），對照孔（細胞、相同濃度的藥物溶解介質、培養液、MTT、二甲基亞砜）。A549 細胞以每孔200 個加入96 孔板，待細胞貼壁后分為對照組、10 μmol/L 淫羊藿素組、20 μmol/L 淫羊藿素組、30 μmol/L 淫羊藿素組和40 μmol/L 淫羊藿素組，分別加入 0、10、20、30、40 μmol/L 的淫羊藿素，每濃度設3 個復孔，同時設空白對照（僅加培養液）。分別干預24、48、72 h后，用上述方法測A 值。細胞活力=實驗孔吸光度值/對照空吸光度值×100%。

1.4 淫羊藿素對A549細胞誘導RAW264.7細胞向OC 分化的影響檢測 因10 μmol/L 以上濃度的淫羊藿素對RAW264.7 細胞活力有影響，因此選用淫羊藿素5、10 μmol/L 兩個濃度進行實驗。取對數生長期的A549細胞和RAW264.7細胞，分別以0.25%胰酶消化，加入DMEM 培養基分別制備5×103/mL 的A549 單細胞懸液和 1×104/mL 的 RAW264.7 單細胞懸液，在 Transwell 上室接種 A549 細胞，Transwell 下室接種RAW264.7 細胞，加入含10% FBS 的DMEM培養基（含100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素）培養，將Transwell 置入6 孔板里，并置于37 ℃、5%CO2培養箱中培養7 d。不加A549 細胞的RAW264.7 細胞（1×104/mL）加RANKL（50 ng/mL），在相同培養條件下培養7 d 作為陽性對照組。將RAW264.7 細胞隨機分為對照組、淫羊藿素低劑量組、淫羊藿素高劑量組，分別加入 0.01% DMSO、5 μmol/L 淫羊藿素、10 μmol/L 淫羊藿素干預48 h，做抗酒石酸磷酸酶（TRAP）染色。20 倍光鏡下觀察并進行TRAP 陽性細胞計數。細胞核數目≥3個且TRAP染色陽性細胞為OC。隨機取5個視野計數。

1.5 OC 凋亡率測算 采用流式細胞術。RAW264.7 與 A549 細胞共培養，待 OC 融合度至70%時，用PBS 漂洗2 遍，按上述淫羊藿素濃度進行處理后，每濃度設3個復孔，繼續培養48 h后收集細胞，制成單細胞懸液，70%冷乙醇固定，4 ℃過夜，檢測前用 PBS 洗去固定液，加入 20 μL Rnase A，37 ℃孵育 30 min，暗處加 PI 染液，冰浴 30 min，以 300 目篩網過濾。調整細胞為1×106/mL，以流式細胞儀進行檢測，激發光源為氬離子，激發波長488 nm，用Multicycle DNA 分析軟件測算細胞凋亡率。

1.6 OC 中 AMPK、mTOR、CTSK mRNA 表達檢測采用實時熒光定量PCR法。用TRIzol試劑從處理過的細胞中提取總RNA，提取總RNA，按北京天根生化公司提供的試劑操作步驟進行操作。用M-MLV First-Strand Syntehsis Kit 將 RNA（2 μg）逆轉錄成互補DNA。AMPK 上游引物序列5'-TTTGCGTGTAC?GAAGGAAGAAT-3'，下游引物序列 5'-CTCTGTG?GAGTAGCAGTCCCT-3'；mTOR 上 游 引 物 序 列 5'-TCCGAGAGATGAGTCAAGAGG-3'，下游引物序列5'-CACCTTCCACTCCTATGAGGC-3'；CTSK 上 游 引物序列 5'-ACTCAAAGTACCCCTGTCTCAT-3'，下游引物序列 5'-CCACAGAGCTAAAAGCCCAAC-3'；βactin 上游引物序列5'-AAAGACCTGTACGCCAA?CAC-3'，下游引物序列 5'-GTCATACTCCTGCTT?GCTGAT-3'。qPCR 反 應體系 20 μL，反應條 件：94 ℃預變性3 min后，94 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30 個循環；72 ℃延伸5 min。通過2-ΔΔCt法計算基因相對表達量。

1.7 OC 中AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR 蛋白表達檢測 采用Western blotting 法。用細胞裂解液提取細胞蛋白，用蛋白定量試劑盒定量。將蛋白樣品用12%SDS 聚丙烯酰胺凝膠進行電泳，每個蛋白樣品上樣量為50 μg，蛋白進入分離膠后用120 V 恒壓電泳，用濕轉法進行轉膜。封閉液（PBST+5 g/L脫脂奶粉）將膜置于室溫封閉1 h，按工作濃度加入一抗，4 ℃封閉過夜。將膜用 TBST 漂洗 3 次后，用 HRP 偶聯的二抗室溫孵育1 h，TBST 漂洗3 次，而后加入化學發光試劑，用X 線曝光顯影。用凝膠成像系統分析，以β-actin 做內參照，蛋白相對表達量=蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值。

1.8 統計學處理 用SPSS25.0 統計軟件。計量資料用±s表示，多組比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 淫羊藿素對A549 細胞、RAW264.7 細胞活力的影響 各組A549 細胞、RAW264.7 細胞活力比較見表1、2。

表1 各組RAW264.7細胞活力比較（%，±s）

表1 各組RAW264.7細胞活力比較（%，±s）

注：與對照組比較，*P<0.05。

組別對照組0.1 μmol/L淫羊藿素組1 μmol/L淫羊藿素組10 μmol/L淫羊藿素組100 μmol/L淫羊藿素組細胞活力干預24 h 100.0±3.1 98.5±6.8 95.2±3.3 94.1±4.2 75.2±6.5*干預48 h 98.2±2.2 96.2±8.1 94.1±4.6 95.2±3.7 68.1±5.8*干預72 h 99.3±3.9 94.1±7.5 95.3±4.3 93.3±3.4 60.2±4.5*

表2 各組A549細胞活力比較（%，±s）

表2 各組A549細胞活力比較（%，±s）

注：與對照組比較，*P<0.05；與同組24、48 h比較，#P<0.05。

組別對照組10 μmol/L淫羊藿素組20 μmol/L淫羊藿素組30 μmol/L淫羊藿素組40 μmol/L淫羊藿素組細胞活力干預24 h 100.0±2.1 90.5±4.9 86.2±3.1*52.6±5.2*37.3±5.5*干預48 h 102.2±4.2 86.3±5.2 80.2±5.9 45.7±3.9*34.1±3.6*干預72 h 100.3±4.5 85.4±6.5 72.2±3.3*38.3±4.1*#22.6±2.3*#

2.2 淫羊藿素對A549 細胞誘導RAW264.7 向OC分化的影響 陽性對照組、對照組、5 μmol/L 淫羊藿素組、10 μmol/L 淫羊藿素組 OC 數量分別為（90 ±2）、（98 ± 3）、（34± 3）、（20± 2）個。陽性對照組與對照組OC數量比較差異無統計學意義（P>0.05）；與對照組比較，5 μmol/L淫羊藿素組、10 μmol/L淫羊藿素組OC數量少（P均<0.05）；與5 μmol/L淫羊藿素組比較，10 μmol/L淫羊藿素組OC數量少（P<0.05）。

2.3 淫羊藿素對OC凋亡的影響 對照組、5 μmol/L淫羊藿素組、10 μmol/L 淫羊藿素組OC 凋亡率分別為（4.8 ± 0.5）%、（7.8 ± 0.6）%、（9.7 ± 0.6）%。與對照組比較，5 μmol/L 淫羊藿素組、10 μmol/L 淫羊藿素組 OC 凋亡率高（P均<0.05）；5 μmol/L 淫羊藿素組與10 μmol/L淫羊藿素組OC凋亡率比較差異無統計學意義（P>0.05）。

2.4 淫羊藿素對OC 中CTSK、AMPK、mTOR mRNA表達的影響 與對照組比較，5 μmol/L 淫羊藿素組、10 μmol/L 淫羊藿素組 OC 中 CTSK mRNA 相對表達量低、AMPK mRNA 相對表達量高、mTOR mRNA 相對表達量低（P均<0.05）；與5 μmol/L 淫羊藿素組比較，10 μmol/L 淫羊藿素組 OC 中 CTSK mRNA 表達低、AMPK mRNA 相對表達量高、mTOR mRNA 相對表達量低（P均<0.05）。見表3。

表3 各組OC中CTSK、AMPK、mTOR mRNA相對表達量比較（±s）

表3 各組OC中CTSK、AMPK、mTOR mRNA相對表達量比較（±s）

注：與對照組比較，*P<0.05；與 5 μmol/L 淫羊藿素組比較，#P<0.05。

組別對照組5 μmol/L淫羊藿素組10 μmol/L淫羊藿素組CTSK mRNA 1.00±0.03 0.66±0.05*0.45±0.08*#AMPK mRNA 1.00±0.02 1.39±0.09*1.62±0.08*#mTOR mRNA 1.00±0.05 0.79±0.07*0.35±0.04*#

2.5 淫羊藿素對OC 中AMPK、p-AMPK、mTOR、pmTOR 蛋白表達比較 與對照組比較，5 μmol/L 淫羊藿素組、10 μmol/L 淫羊藿素組 OC 中 AMPK、p-AMPK蛋白相對表達量高，mTOR、p-mTOR蛋白相對表達量低（P均<0.05）；與 5 μmol/L 淫羊藿素組比較，10 μmol/L 淫羊藿素組 OC AMPK、p-AMPK 蛋白相對表達量高，mTOR、p-mTOR 蛋白相對表達量低（P<0.05）。見表4。

表4 各組OC中AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR蛋白相對表達量比較（±s）

表4 各組OC中AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR蛋白相對表達量比較（±s）

注：與對照組比較，*P<0.05；與5 μmol/L淫羊藿素組比較，#P<0.05。

組別對照組5 μmol/L淫羊藿素組10 μmol/L淫羊藿素組AMPK蛋白1.00±0.09 1.46±0.04*1.79±0.08*#p-AMPK蛋白1.00±0.04 1.29±0.02*1.42±0.05*#mTOR蛋白1.00±0.05 0.81±0.07*0.61±0.02*#p-mTOR蛋白1.00±0.04 0.78±0.04*0.61±0.03*#

3 討論

淫羊藿素是補腎壯骨中藥淫羊藿的主要成分，是淫羊藿苷在動物體內代謝后脫去糖基的活性成分，是淫羊藿口服吸收后發揮藥理活性的主要成分［6］。淫羊藿素分子式C21H20O6，相對分子質量為368.38。目前淫羊藿及其代謝產物在抗骨質疏松骨代謝方面已成為研究熱點。研究發現，淫羊藿素可通過下調骨硬化蛋白表達來促進人骨髓間充質干細胞的成骨作用［7］。也有研究發現淫羊藿苷能通過上調OC 的雌激素受體α mRNA 表達進而下調RANK mRNA 表達來抑制RANKL誘導RAW264.7向OC分化和骨吸收活性［8］；同時研究還發現，淫羊藿素可誘導骨髓間充質干細胞向成骨細胞分化［9-10］。基于此，本課題組通過建立肺癌細胞與OC前體細胞體外非接觸培養模型，發現A549細胞可誘導OC前體細胞分化為OC的數量與RANKL誘導的數量相似，這說明A549細胞在體外可誘導OC分化。通過細胞活力檢測發現10 μmol/L以下濃度的淫羊藿素對A549 細胞和RAW264.7 細胞無明顯抑制作用，卻可明顯減少OC 的數量，TRAP陽性的僅20個，同時也使OC 標志物CTSK mRNA 表達降低，并且具有濃度依賴性。利用流式細胞術檢測細胞凋亡情況，發現10 μmol/L的淫羊藿素可誘導OC 凋亡，但凋亡率僅9.7%，而5 μmol/L 的淫羊藿素組OC 凋亡率僅7.8%。因此，本課題組推測淫羊藿素減少肺癌A549細胞誘導RAW264.7向OC分化的數量，細胞凋亡不是占主要作用，可能主要是通過某些信號通路抑制OC的分化。

目前最新研究表明，AMPK 信號通路在骨代謝中同樣起著非常重要的作用。AMPK 的活化可以在體外促進骨生成，并且AMPK α 或β 亞基的缺失可以降低大鼠骨量［11］。JANG 等［12］研究發現，AMPK 的活化可抑制成骨細胞分化，同時也有研究發現，AMPK 亦參與了OC 的成熟和分化。研究表明，在OC 活化和骨吸收溶解過程中AMPK 可能發揮了重要作用［13-14］。AMPK 是否參與肺癌細胞誘導 OC 分化，目前鮮有報道。因而本研究采用qPCR 及West?ern blotting 法檢測發現，淫羊藿素可上調AMPK mRNA 和 AMPK 及 p-AMPK 蛋白的表達，并且高濃度淫羊藿素組較低濃度淫羊藿素組作用強。表明淫羊藿素可能通過激活AMPK 抑制肺癌細胞誘導RAW264.7向OC分化。

mTOR 是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其包括mTORC1、mTORC2。mTORC1 是 AMPK 下游重要的信號分子，對于蛋白質翻譯、細胞生長增殖、凋亡和自噬等具有重要的調控作用［15-16］。本研究發現，淫羊藿素下調mTOR mRNA、蛋白及p-mTOR 蛋白的表達。結果表明mTOR 可能也參與了淫羊藿素抑制肺癌誘導RAW264.7向OC分化的過程。

綜上所述，淫羊藿素可激活AMPK 和p-AMPK，并且下調mTOR 和p-mTOR 的表達，從而抑制RAW264.7 和A549 細胞共培養體系中OC 的分化。由此，推測淫羊藿素通過AMPK/mTOR 信號通路抑制肺癌細胞誘導RAW264.7 向OC 分化，這為肺癌骨轉移的防治提供新的思路和靶點。