天麻素腹腔注射對慢性偏頭痛大鼠的治療作用及機(jī)制

宋維偉，陳金波，張德福，鄭海非，宋曉文，董曉夢，魯文先

濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東濱州256600

偏頭痛是一種原發(fā)性疾患，其發(fā)作時(shí)為中度至重度頭痛，伴有惡心、嘔吐或畏光、畏聲等癥狀，部分患者伴有短暫的局灶性神經(jīng)癥狀。目前偏頭痛分為六大類，包括先兆偏頭痛、無先兆偏頭痛、慢性偏頭痛、偏頭痛并發(fā)癥、很可能的偏頭痛以及可能與偏頭痛相關(guān)的周期綜合征［1］。慢性偏頭痛是一種高度致殘的疾病，其特征是每月至少15 d頭痛，其中至少8 d必須符合偏頭痛標(biāo)準(zhǔn)［1］，其患病率為1%～2%，每年約2.5%的偏頭痛患者進(jìn)展為慢性偏頭痛［2］。引起偏頭痛慢性化的病理生理機(jī)制尚不完全清楚。且慢性偏頭痛仍未有明確的診治方案。近年來，中藥治療慢性偏頭痛越來越受到關(guān)注。天麻素作為天麻制劑主要的活性物質(zhì)，其緩解慢性偏頭痛的療效受到臨床肯定。2019 年 9 月—2020 年 1 月，我們探討了天麻素對慢性偏頭痛大鼠的治療作用及機(jī)制，報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、試劑與儀器 清潔級成年雄性SD 大鼠24 只，體質(zhì)量250～300 g，3～4 月齡，由濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司提供，飼養(yǎng)于濱州醫(yī)學(xué)院SPF 級動(dòng)物飼養(yǎng)中心，12 h 明暗環(huán)境循環(huán)，溫度20～25 ℃，濕度40%～70%，隨意飲食。天麻素、托吡酯（上海源葉生物科技有限公司），腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）抗體、降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）抗體、β-actin 抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司），辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG、Western blotting 試劑盒（博士德生物公司），F(xiàn)ITC-驢抗兔IgG（美國Abcam公司）、RT-PCR 試劑盒（普洛麥格生物技術(shù)有限公司），BDNF、CGRP、GAPDH 引物（上海捷瑞生物工程有限公司）。電子稱重儀及高精度電子天平（法國Bioseb 公司），Vonfery 電子機(jī)械痛測試儀（美國IITC公司），BW-Plantar 390 足底熱測痛儀（美國IITC 公司），實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（羅氏公司），酶標(biāo)儀、電泳儀、濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜儀（美國Bio-Rad 公司）、低溫高速離心機(jī)（德國Eppendorf公司）。

1.2 動(dòng)物分組、藥物干預(yù)及模型制備 將大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對照組、模型組、托吡酯組、天麻素組各6 只。采用間歇性腹腔注射硝酸甘油（NTG）建立慢性偏頭痛大鼠模型［3-4］，即每隔1 d給予模型組、托吡酯組、天麻素組腹腔注射1次硝酸甘油（NTG）10 mg/kg，空白對照組腹腔注射生理鹽水5 mL，均注射5 次。注射NTG 前30 min，模型組、托吡酯組、天麻素組分別給予腹腔注射生理鹽水5 mL、托吡酯 30 mg/kg、天麻素 200 mg/kg，每日 1 次，共干預(yù)11 d；空白對照組不給予藥物干預(yù)。

1.3 大鼠行為學(xué)觀察 在干預(yù)第3、5、7、9、11天，將大鼠置于安靜環(huán)境中觀察并記錄大鼠撓頭、打轉(zhuǎn)及爬籠次數(shù)。行為學(xué)評分標(biāo)準(zhǔn)［5］：撓頭連續(xù)10 次計(jì)1分，每增加1次加計(jì)0.1分；打轉(zhuǎn)2次計(jì)1分，每增加1次加計(jì)1分；爬籠3次計(jì)1分，每增加1次加計(jì)1分。

1.4 大鼠疼痛閾值檢測 干預(yù)第3、5、7、9、11天給予NTG前后測試各組機(jī)械閾值與熱痛閾值，于08：00—15：00 弱光安靜條件下進(jìn)行測試。大鼠在刺激下抬起或抖動(dòng)爪子被認(rèn)為是目標(biāo)反應(yīng)。采用電子Vonfrey測痛儀，重復(fù)測量3 次，每次間隔3 min，取其平均值作為大鼠機(jī)械痛閾；采用足底熱測痛儀測定大鼠熱縮足潛伏期，重復(fù)測量3 次，每次間隔2 min，取平均值作為大鼠熱痛閾。

1.5 大鼠三叉神經(jīng)節(jié)（TG）及三叉神經(jīng)脊束尾側(cè)核（TNC）中BDNF、CGRP mRNA 表達(dá)檢測 采用RTPCR 法。在第11 天完成痛閾測定后用水合氯醛深麻醉大鼠，置于冰上取大鼠TG、TNC 于-80 ℃保存。用RNA 提取試劑盒將組織裂解稀釋提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，于-20 ℃保存。設(shè)計(jì)BDNF、CGRP 引物，用GAPDH 作為內(nèi)參。BDNF 上游引物5'-TGT?GACAGTATTAGCGAGTGGGT-3'，下 游 引 物 5'-CGATTGGGTAGTTCGGCATT-3'；CGRP上游引物5'-AGAAGAGATCCTGCAACACTGCCA-3'，下 游 引 物5'-GGCACAAAGTTGTCCTTCACCACA-3'； GAPDH上游引物5'-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3'，下游引物5'-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3'。PCR擴(kuò)增：反應(yīng)體系20 μL，2×AceQ qPCRGreen Mas?ter Mix（High ROX Premixed）10 μL、Primer1 0.4 μL、Primer2 0.4 μL、Template cDNA 1 μL、ddH2O 8.2 μL，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，循環(huán)40次。采用2-ΔΔCt法計(jì)算基因相對表達(dá)量。

1.6 大鼠 TG、TNC 內(nèi) BDNF、CGRP 蛋白表達(dá)檢測 采用Western blotting 法。在第11 天完成痛閾測定后用水合氯醛深麻醉大鼠，置于冰上取TG、TNC放入滅菌EP管中加入裂解液及蛋白酶抑制劑，使用勻漿器將組織磨成勻漿狀態(tài)，4 ℃12 000 g離心10 min。采用BCA 法檢測上清液中的蛋白濃度。加入上樣緩沖液和裂解液將蛋白樣品的濃度配平，100 ℃加熱5 min 使蛋白變性，分裝后保存于-80 ℃冰箱備用。配置SDS-PAGE 膠，加入蛋白質(zhì)樣本電泳后轉(zhuǎn)移到PVDF 膜。將膜浸泡在封閉緩沖液中室溫1 h。加一抗BDNF（1∶200）、CGRP（1∶500）、β-ac?tin（1∶1 000）4 ℃孵育1 夜。用 TBST 清洗 3 次，每次10 min，加二抗室溫孵育1 h。膜在TBST 中再次洗滌3 次，每次10 min，曝光后用Image J 圖像分析軟件檢測目的條帶校正后的灰度值，以目的條帶與內(nèi)參的灰度比值表示其相對表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s表示，比較采用重復(fù)測量方差分析或單因素方差分析，兩兩比較采用Bonferroni 法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組不同時(shí)間點(diǎn)痛閾比較 與空白對照組比較，模型組不同時(shí)間點(diǎn)基礎(chǔ)機(jī)械痛閾、基礎(chǔ)熱痛閾、急性機(jī)械痛閾、急性熱痛閾均低（P均<0.05）；與模型組比較，托吡酯組、天麻素組不同時(shí)間點(diǎn)基礎(chǔ)機(jī)械痛閾、基礎(chǔ)熱痛閾、急性機(jī)械痛閾、急性熱痛閾均高（P均<0.05）；天麻素組不同時(shí)間點(diǎn)基礎(chǔ)機(jī)械痛閾、基礎(chǔ)熱痛閾、急性機(jī)械痛閾、急性熱痛閾與托吡酯組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均>0.05）。見表1。

表1 各組不同時(shí)間點(diǎn)的痛閾值（±s）

表1 各組不同時(shí)間點(diǎn)的痛閾值（±s）

組別空白對照組干預(yù)第3天干預(yù)第5天干預(yù)第7天干預(yù)第9天干預(yù)第11天模型組干預(yù)第3天干預(yù)第5天干預(yù)第7天干預(yù)第9天干預(yù)第11天托吡酯組干預(yù)第3天干預(yù)第5天干預(yù)第7天干預(yù)第9天干預(yù)第11天天麻素組干預(yù)第3天干預(yù)第5天干預(yù)第7天干預(yù)第9天干預(yù)第11天n 6 6 6 6基礎(chǔ)機(jī)械痛閾（g）52.00±2.78 55.00±7.50 43.00±6.98 48.00±7.83 49.00±3.57 49.00±6.74 40.00±4.27 33.00±4.84 30.00±2.42 39.00±1.45 49.00±6.74 40.00±4.27 33.00±4.84 30.00±2.42 39.00±1.45 52.00±5.12 54.00±7.67 34.00±2.96 24.00±4.55 26.00±3.33基礎(chǔ)熱痛閾（s）13.47±1.46 10.60±2.59 13.00±1.88 10.00±0.83 9.80±0.68 14.42±1.53 6.30±1.02 5.18±0.97 5.30±0.53 4.70±1.05 13.52±1.39 9.49±0.19 9.1±0.46 10.80±1.25 10.64±1.21 14.07±2.38 9.89±0.82 8.78±1.44 8.60±1.34 9.30±1.66急性機(jī)械痛閾（g）43.00±2.30 39.00±4.52 49.00±3.67 53.00±3.85 47.00±1.74 18.00±3.56 12.00±3.05 11.00±2.56 8.00±1.72 7.00±1.78 48.00±3.08 40.00±3.31 31.00±5.15 27.00±5.54 30.00±3.64 41.00±1.57 37.00±2.31 31.00±2.31 25.00±3.57 29.00±3.00急性熱痛閾（s）12.51±2.21 9.39±1.35 12.00±3.45 12.87±2.40 9.00±1.67 6.48±0.93 5.50±0.57 5.00±0.61 4.60±0.90 4.30±0.69 8.06±1.04 8.5±2.01 7.27±1.34 7.00±1.10 8.1±1.45 8.85±1.70 8.16±1.45 7.03±1.56 6.98±1.00 6.88±1.27

2.2 各組干預(yù)前后行為學(xué)評分比較 干預(yù)前各組行為學(xué)評分比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均>0.05）；干預(yù)后除空白對照組外，其他各組行為學(xué)評分較治療前升高（P均<0.05）。干預(yù)后，與模型組比較，托吡酯組、天麻素組行為學(xué)評分低（P均<0.05）；天麻素組行為學(xué)評分與托吡酯組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表2。

2.3 各組不同部位BDNF、CGRP mRNA 表達(dá)比較 與空白對照組比較，模型組BDNF、CGRP mRNA 相對表達(dá)量高（P均<0.05）；與模型組比較，托吡酯組、天麻素組CGRP、BDNF mRNA 相對表達(dá)量低（P均<0.05）；天麻素組CGRP、BDNF mRNA 相對表達(dá)量與托吡酯組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均>0.05）。見表3。

表2 各組干預(yù)前后的行為學(xué)評分（分，±s）

表2 各組干預(yù)前后的行為學(xué)評分（分，±s）

組別空白對照組模型組托吡酯組天麻素組n 6 6 6 6行為學(xué)評分干預(yù)前2.20±0.28 2.50±0.46 2.50±0.45 2.70±0.60干預(yù)后2.10±0.29 14.40±1.47 8.10±0.98 7.60±0.57

2.4 各組不同部位BDNF、CGRP 蛋白表達(dá)比較與空白對照組比較，模型組BDNF、CGRP 蛋白相對表達(dá)量高（P均<0.05）；與模型組比較，托吡酯組、天麻素組 CGRP、BDNF 蛋白相對表達(dá)量低（P均<0.05）；天麻素組 CGRP、BDNF 蛋白相對表達(dá)量與托吡酯組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均>0.05）。見表4。

表4 各組不同部位BDNF、CGRP蛋白的相對表達(dá)量（±s）

表4 各組不同部位BDNF、CGRP蛋白的相對表達(dá)量（±s）

組別空白對照組模型組托吡酯組天麻素組n 6 6 6 6 BDNF蛋白TG 0.45±0.02 0.61±0.01 0.48±0.02 0.48±0.01 TNC 0.24±0.01 0.49±0.02 0.38±0.01 0.38±0.02 CGRP蛋白TG 0.74±0.01 0.98±0.03 0.78±0.01 0.80±0.07 TNC 0.49±0.01 0.94±0.09 0.64±0.04 0.70±0.01

表3 各組不同部位BDNF、CGRP mRNA的相對表達(dá)量（±s）

表3 各組不同部位BDNF、CGRP mRNA的相對表達(dá)量（±s）

組別空白對照組模型組托吡酯組天麻素組n 6 6 6 6 BDNF mRNA TG 1 4.30±0.17 2.80±0.24 2.60±0.07 TNC 1 3.30±0.22 1.90±0.20 1.85±0.12 CGRP mRNA TG 1 5.20±0.30 2.87±0.08 3.00±0.07 TNC 1 4.70±0.08 3.00±0.20 3.05±0.13

3 討論

偏頭痛通常是一種發(fā)作性疾病，但隨著發(fā)作頻率和程度的增加會造成偏頭痛慢性化。目前應(yīng)用于預(yù)防慢性偏頭痛的藥物并非專門用來治療偏頭痛，CGRP 拮抗劑也在臨床試驗(yàn)階段。不足50%的慢性偏頭痛患者對現(xiàn)有治療感到滿意，仍有部分患者對目前的療法表示無效或耐受性差［6］；且多數(shù)治療慢性偏頭痛的藥物不良反應(yīng)大。中藥天麻在我國有兩千多年的藥用歷史，天麻素是天麻制劑主要活性成分之一。研究發(fā)現(xiàn)，天麻素通過降低傷害性初級感覺神經(jīng)元的興奮性而抑制糖尿病性神經(jīng)痛大鼠觸摸痛和痛覺過敏［7］；通過調(diào)節(jié)神經(jīng)肽降低大鼠體內(nèi)一氧化氮水平來預(yù)防急性偏頭痛［8］。

目前慢性偏頭痛的病理生理機(jī)制尚不明確，慢性偏頭痛患者的感覺閾值降低而易感性增加，這提示中樞及外周敏化慢性偏頭痛發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。中樞敏化是由C纖維傷害性感受器持續(xù)輸入引起的脊髓和延髓背角神經(jīng)元興奮性增加所致。重復(fù)刺激三叉神經(jīng)纖維可以導(dǎo)致傷害性神經(jīng)遞質(zhì)（CGRP、谷氨酸）和（或）離子通道或感覺性受體表達(dá)增多，使外周神經(jīng)元即腦膜和硬腦膜三叉神經(jīng)感覺傳入神經(jīng)元興奮性增加，興奮性沖動(dòng)繼續(xù)上傳至丘腦，進(jìn)一步促進(jìn)中樞敏感化，導(dǎo)致偏頭痛發(fā)作。持續(xù)的中樞及外周敏化可能導(dǎo)致機(jī)體對刺激產(chǎn)生疼痛夸大，自覺疼痛時(shí)間延長，對正常無害的刺激產(chǎn)生痛覺反應(yīng)。其最常見臨床表現(xiàn)為皮膚超敏（CA），這是一種以普通的非傷害性刺激引起皮膚異常疼痛為特征的神經(jīng)系統(tǒng)狀況［9］。臨床研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)慢性偏頭痛患者在發(fā)作過程會經(jīng)歷CA。CA 被認(rèn)為是慢性偏頭痛患者對曲普坦治療反應(yīng)差的預(yù)測因子，也是疾病進(jìn)展的危險(xiǎn)因素及對治療藥物藥效的預(yù)測因子。本研究使用慢性偏頭痛相關(guān)動(dòng)物模型［3-4］，通過反復(fù)給予NTG 使大鼠產(chǎn)生兩種不同的疼痛狀態(tài)，即每次注射NTG 后出現(xiàn)急性痛覺過敏，隨著時(shí)間推移逐漸發(fā)展為慢性痛覺過敏，這種慢性基礎(chǔ)痛敏在停止NTG 后持續(xù)數(shù)天，以模擬偏頭痛慢性化狀態(tài)。該模型已經(jīng)進(jìn)行了測試，被認(rèn)為是研究慢性偏頭痛相關(guān)疼痛的可靠動(dòng)物模型［4］。本研究刺激慢性偏頭痛大鼠足底皮膚發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠痛閾明顯下降，與模型組比較，托吡酯組、天麻素組大鼠疼痛閾值增高，提示托吡酯及天麻素可以抑制大鼠痛閾的降低，阻止NTG 誘導(dǎo)的慢性偏頭痛大鼠基礎(chǔ)超敏反應(yīng)和急性超敏反應(yīng)。

近年來，BDNF 在調(diào)節(jié)疼痛信號和中樞敏化中的作用備受關(guān)注。BDNF 是腦組織中最豐富的神經(jīng)營養(yǎng)蛋白，主要從豬腦中分離出來，屬于神經(jīng)生長因子家族，是由BDNF 基因編碼的蛋白質(zhì)，可由多種細(xì)胞（感覺神經(jīng)元、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元、免疫細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞）產(chǎn)生［10］。BDNF 廣泛參與了神經(jīng)生理過程，被認(rèn)為是神經(jīng)可塑性的驅(qū)動(dòng)力，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)生長、發(fā)育和存活具有重要作用，是中樞和周圍疼痛反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)劑。數(shù)據(jù)表明，BDNF 拮抗劑減弱了甲醛誘導(dǎo)的痛覺過敏和角叉菜膠誘導(dǎo)的熱痛覺過敏［11］。在促成中樞敏化的機(jī)制中，N-甲基-d-天冬氨酸（NMDA）受體的激活起著關(guān)鍵作用。BDNF 激活trkB 受體會導(dǎo)致NMDA 受體亞基NR1 和NR2B 磷酸化和激活，從而促進(jìn)背角神經(jīng)元的敏化參與外周及中樞敏化。有研究表明，BDNF 與CGRP 在TG 中共表達(dá)，并且有可能促進(jìn)了TG 中BDNF 的釋放。CGRP 是偏頭痛病理生理機(jī)制的關(guān)鍵參與者之一。BDNF 可能通過參與三叉神經(jīng)傷害性通路的中樞敏化機(jī)制參與慢性偏頭痛發(fā)生發(fā)展。本研究中模型組BDNF 與CGRP 的mRNA 及蛋白表達(dá)均上調(diào)，可見二者參與了慢性偏頭痛的發(fā)生發(fā)展。

本研究結(jié)果顯示，托吡酯可有效抑制由NTG 誘導(dǎo)的慢性偏頭痛大鼠的急性及慢性痛覺過敏，而天麻素與托吡酯治療效果相似，可有效抑制慢性偏頭痛大鼠的急性及基礎(chǔ)超敏反應(yīng)。另外研究結(jié)果顯示，托吡酯及天麻素可抑制BDNF 與CGRP 的表達(dá)。托吡酯通過阻斷鈣離子通道，可抑制三叉神經(jīng)末梢釋放CGRP 和谷氨酸［12］。推測托吡酯抑制了CGRP的釋放，從而干擾了BDNF 的表達(dá)。天麻素可能通過抑制BDNF 及CGRP 從初級感覺傷害感受器中釋放，改變了突觸后神經(jīng)元的興奮性，阻止了中樞敏化的形成。

天麻素目前多用于心腦血管保護(hù)，不良反應(yīng)較少，在治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病方面有廣闊前景。本研究證實(shí)天麻素可能通過抑制初級感覺傷害感受器中釋放BDNF、CGRP，降低神經(jīng)元興奮性，改變了突觸可塑性，從而預(yù)防慢性偏頭痛的發(fā)生發(fā)展。這為研發(fā)天麻素及其衍生物治療慢性偏頭痛提供理論基礎(chǔ)。