甲狀腺乳頭狀癌組織中lncRNA MIR31HG表達變化及意義

張小麗，海濤，劉文清，李非

首都醫科大學宣武醫院，北京100053

甲狀腺癌是頭頸部常見的惡性腫瘤之一，近年來，其發病率呈現快速增長的趨勢［1］。甲狀腺癌常見的病理類型包括甲狀腺乳頭狀癌（PTC）、髓樣癌、未分化癌及濾泡狀癌。其中，PTC最為常見，約占所有病理類型的90%［2］。目前，甲狀腺癌的治療包括手術治療、促甲狀腺激素抑制治療、放射性碘治療及分子靶向治療等。但部分患者腫瘤惡性程度較高，易發生局部浸潤及遠處轉移，患者預后較差［3］。因此，深入研究PTC發生發展的分子機制，對于尋找新的診斷及治療靶點，改善患者的預后，具有重要臨床價值［4］。長鏈非編碼RNA（lncRNA）MIR31HG 基因位于染色體9p21.3，該基因編碼產生長200～300 bp長鏈非編碼RNA，能與多梳蛋白抑制復合體1結合，參與調節正常細胞的分化、發育等生物學過程［5］。有研究報道，lncRNA MIR31HG 在肺癌、胃癌及結直腸癌等多種腫瘤中均存在表達異常升高的現象，其通過抑制下游腫瘤抑制因子p16 的表達，促進腫瘤細胞的惡性進展［6-7］。此外，在體外細胞實驗中發現，PTC 細胞中lncRNA MIR31HG 的表達能夠促進腫瘤細胞內蛋白激酶B（AKT）的磷酸化，促進PTC細胞的增殖和遷移［8］。本研究通過檢測PTC 組織中lncRNA MIR31HG的表達，初步探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取 2014 年 1 月—2015 年 1 月本院確診為 PTC 的患者 86 例，男 30 例，女性 56 例；年齡30～66（49.2 ± 6.5）歲；伴淋巴結轉移39 例，無淋巴結轉移 47 例；腫瘤直徑≤2 cm 38 例，>2 cm 48 例；伴局部浸潤35 例，無局部浸潤51 例；腫瘤TNM 分期：Ⅰ、Ⅱ期54例，Ⅲ、Ⅳ期32例。患者納入標準：均為首次診治且經病理學檢查明確診斷為PTC；未接受放化療及免疫治療；臨床資料完整，患者及家屬對本研究知情同意并簽字。排除標準：PTC復發；合并PTC家族遺傳病病史、精神疾病病史；合并甲狀腺功能亢進等內分泌系統疾病。本研究經醫院醫學倫理委員會批準。

1.2 PTC 及癌旁正常組織中lncRNA MIR31HG 表達檢測 采用實時熒光定量PCR（qPCR）法。收集PTC患者經甲狀腺全切或部分切術中新鮮腫瘤組織及癌旁正常組織（距離腫瘤邊緣>2 cm，經病理學檢查明確診斷），TRIzol 法抽提組織RNA，紫外分光光度計測組織RNA 的濃度。隨后進行反轉錄合成cD?NA。以 cDNA 為模板，進行 qPCR 反應。qPCR 反應條件：95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 10 min，共40 個循環。反應體系：2×SYBR Premix 10 μL、上游及下游引物各 0.5 μL、cDNA 模板 1 μL、ddH2O 8 μL。以U6 為內參，用 2-ΔΔCt法計算組織中 lncRNA MIR31HG的相對表達量。U6 上游引物序列：5'-GATTATC?GGGACCATTCCACTG-3'，下游引物序列5'-GATCT?GGTTCCCAATGACTGTG-3'；lncRNA MIR31HG上游引物序列 5'-TTCTGTCCTCCTACTCGGACCC-3'，下游引物序列5'-TTCTGTCCTCCTACTCGGACCC-3'。

1.3 隨訪 對所有PTC患者自出院起開始隨訪，每半年進行1次門診隨訪，記錄患者復發、轉移及生存情況，隨訪截至2020年2月或患者死亡，統計5年總體生存率（OS）。

1.4 統計學方法 采用SPSS20.0 統計軟件。計量資料用±s表示，比較采用t檢驗；用 Kaplan-Meier生存曲線（Log-rank 檢驗）分析PTC 患者預后；COX回歸分析PTC 患者不良預后的危險因素。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PTC 及癌旁正常組織中lncRNA MIR31HG 表達比較 PTC 組織、癌旁正常組織中lncRNA MIR31HG 相對表達量分別為 1.472 ± 0.309、0.611± 0.123，PTC 組織中 lncRNA MIR31HG 相對表達量較癌旁正常組織高（t=24.008，P<0.05）。

2.2 PTC 組織中lncRNA MIR31HG 表達與患者臨床病理特征的關系 不同性別、年齡患者PTC 組織中lncRNA MIR31HG 的表達比較差異無統計學意義（P均>0.05）。TNM 分期Ⅲ、Ⅳ期，腫瘤直徑>2 cm、局部浸潤及伴淋巴結轉移的患者PTC 組織中ln?cRNA MIR31HG 表達高于 TNM 分期Ⅰ、Ⅱ期，腫瘤直徑≤2 cm、無局部浸潤及無淋巴結轉移的患者（P均<0.05）。見表1。

2.3 PTC 組織中lncRNA MIR31HG 表達與患者預后的關系 隨訪2～60（38.2±5.5）個月，隨訪期間無失訪病例，死亡10例，存活76例，5年OS為88.3%（76/86）。以 PTC 組織中 lncRNA MIR31HG 表達的平均數1.468為界值，分為高表達組42例，低表達組44 例 。 lncRNA MIR31HG 高 表 達 組 5 年 OS 為78.6%（33/42），低表達組5 年OS 為97.7%（43/44）。高表達組 5 年 OS 低于低表達組（χ2=4.949，P<0.05）。

2.4 PTC患者預后的影響因素 lncRNA MIR31HG高表達、腫瘤TNM 分期高及淋巴結轉移是PTC 患者預后不良的獨立危險因素，見表2。

表1 PTC組織中lncRNA MIR31HG表達與患者臨床病理特征的關系（-x± s）

3 討論

甲狀腺癌是常見的內分泌系統腫瘤，女性發病率較高。甲狀腺癌的病理類型中以PTC 最為常見。多數PTC 患者預后較好，但仍有少數患者出現復發及轉移等，甚至進展為未分化型甲狀腺癌，危及患者生命［9］。因此，深入研究PTC 的發病及疾病進展的機制，有助于發現新的PTC 早期診斷指標及治療藥物的研發。目前研究認為，腫瘤的發生與遺傳因素、環境因素等有關，涉及癌基因的過度激活和抑癌基因的失活，多條信號傳導通路如絲裂原激活的蛋白激酶通路、AKT 通路的過度激活導致腫瘤細胞過度增殖、凋亡抑制及咋了血管生成增加，促進腫瘤的發生發展［10］。腫瘤細胞內信號傳導通路受到多種因素調控。非編碼RNA（ncRNA）是近年來發現的調控基因表達的重要分子，在轉錄水平、翻譯水平、翻譯后修飾等各水平影響下游靶基因表達，調控細胞增殖、分化及凋亡等過程［11］。

lncRNA 是長度大于200 bp的ncRNA，以堿基互補配對的方式與靶基因結核調控基因的轉錄、蛋白質翻譯等過程，與感染、自身免疫性疾病及惡性腫瘤等疾病關系密切［12］。lncRNA MIR31HG 基因位于人類9號染色體，基因全長1 126個堿基，在結直腸癌、肝癌及膀胱癌等多種人類惡性腫瘤中均存在異常表達升高的現象，是腫瘤發生發展過程中的重要致癌基因［13］。YAN 等［14］報道 lncRNA MIR31HG 的表達水平升高可結合并抑制miR-575 的表達，從而促進致瘤樣因子7的表達，導致腫瘤細胞的過度增殖、浸潤轉移能力增加。本研究表明，PTC 患者癌組織中lncRNA MIR31HG 表達明顯較癌旁正常組織升高，其機制可能與lncRNA MIR31HG 基因的表觀遺傳學調控有關。 研究表明，正常細胞中lncRNA MIR31HG 基因啟動子處于高甲基化的狀態；而腫瘤發生時，lncRNA MIR31HG 基因的甲基化轉移酶活性升高，導致lncRNA MIR31HG 基因啟動子區去甲基化，促進lncRNA MIR31HG基因的轉錄，導致腫瘤中 lncRNA MIR31HG 表達水平升高［15］。本研究中腫瘤分期高、腫瘤直徑>2 cm、伴局部浸潤及伴淋巴結轉移患者癌組織中lncRNA MIR31HG 表達水平較高，表明癌組織中lncRNA MIR31HG 的高表達促進PTC 的發生發展。有研究報道，腫瘤中lncRNA MIR31HG 可作為內源競爭性 RNA 結合 miR-34a，促進癌基因c-myc 的表達，進而促進腫瘤細胞的增殖及血管生成，導致腫瘤發生惡性進展［16］。體外細胞實驗中亦研究表明，非小細胞肺癌細胞系PC9 中ln?cRNA MIR31HG的過表達能夠通過激活表皮生長因子受體/AKT 途徑，抑制線粒體途徑凋亡，抑制細胞凋亡，導致腫瘤的惡性進展［17］。近年來有研究報道，腫瘤中lncRNA MIR31HG 的高表達與患者的不良生存預后有關，有可能成為新的腫瘤診斷治療靶點［18］。本研究中，lncRNA MIR31HG 高表達組 PTC患者的5 年OS 明顯較低，表明PTC 組織中lncRNA MIR31HG 的表達與預后有關，因此檢測癌組織中lncRNA MIR31HG 的表達有可能成為判斷患者生存預后的腫瘤標志物。本研究進一步通過COX 回歸分析PTC 患者預后的危險因素，結果lncRNA MIR31HG 高表達、腫瘤TNM 分期高及淋巴結轉移是PTC 患者預后不良的獨立危險因素。因此，PTC組織中lncRNA MIR31HG 可能是促進腫瘤進展的重要腫瘤標志物，有助于判斷PTC患者的預后。

表2 PTC患者預后不良危險因素的Cox多因素分析

綜上所述，PTC 組織中 lncRNA MIR31HG 表達升高，與PTC 患者不良預后有關。 lncRNA MIR31HG 高表達、腫瘤TNM 分期及淋巴結轉移是影響PTC 患者預后不良的獨立危險因素，有望成為新的判斷PTC患者生存預后的腫瘤標志物。但限于本研究樣本例數有限，有待大樣本多中心研究進一步研究lncRNA MIR31HG的臨床意義。