血清Nε-羧甲基賴氨酸水平與2型糖尿病患者頸動脈鈣化的關系

翁悅，蔣成燕，巴俊強，虞萌

遵義市第一人民醫院，貴州遵義563000

動脈鈣化是2 型糖尿病（T2DM）的主要并發癥，是導致T2DM 患者并發心腦血管疾病的主要因素之一［1］。高血糖、胰島素抵抗可損傷血管內皮功能，加劇氧化應激反應和動脈鈣化進程，T2DM 患者較正常人群發生心腦血管疾病的風險增加2～4 倍［2］。頸動脈是動脈鈣化好發部位，也是反映全身動脈鈣化的窗口，頸動脈超聲評價頸動脈鈣化程度有助于評估T2DM 患者心血管疾病風險［3］。但是頸動脈超聲并不能發現頸動脈管壁出現形態學改變之前的微小變化以及深部血管鈣化情況，因此研究與頸動脈鈣化相關的生物學指標十分必要。Nε-羧甲基賴氨酸（CML）是晚期糖基化終產物之一，被認為是強烈的促血管鈣化劑［4］，可通過激活CML/晚期糖基化終產物受體信號誘導活性氧/p38/絲裂素活化蛋白激酶介導的動脈鈣化級聯反應，促使動脈粥樣硬化進程［5］。本研究檢測 T2DM 患者血清 CML 水平，分析其與頸動脈鈣化的關系，為頸動脈鈣化評估提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2017年5月—2019年10月本院超聲科行頸動脈超聲檢查的T2DM 患者132 例，納入標準：①符合2017 版《中國2 型糖尿病防治指南》診斷標準［6］；②年齡>18歲；③既往無動脈粥樣硬化或心腦血管疾病。排除標準：①1 型糖尿病、妊娠期糖尿病；②既往心腦血管疾病；③先天性頸動脈畸形、動脈瘤。另選擇51例門診體檢健康志愿者為對照組，均排除高血壓、糖尿病、高脂血癥、心腦血管疾病等。本研究獲得醫院醫學倫理會批準，患者及其家屬均簽署知情同意書。

1.2 血清CML檢測 T2DM患者于入院24 h 內、對照組于體檢當日采集空腹肘靜脈血5 mL，于4 ℃，3 000 r/min 離心 15 min，離心半徑 15 cm，取血清保存于-80 ℃超低溫冰箱。檢測時室溫下復融血標本，用酶聯免疫吸附法檢測血清CML。酶標儀購自Synergy HTX 基因有限公司，型號1608301A；試劑盒購自北京科美東雅生物技術有限公司。上述檢測均由本院中心試驗室完成，控制批次變異在6%以內。

1.3 頸動脈鈣化檢測 兩組檢查前禁用血管舒張或收縮藥物，平靜休息30 min。采用Philips iU 22彩超診斷儀，讓患者平臥，暴露頸部，二維灰階超聲顯示顱外段椎動脈血管走行方向，探查管壁內或突出于管腔的高回聲為頸動脈鈣化，每條血管選擇鈣化最嚴重病變部位，根據鈣化長度進行評分，鈣化長度<0.1 cm 為無血管鈣化，計0 分，0.1 cm≤鈣化長度≤1 cm 計 1 分，1 cm<鈣化長度≤2 cm 計 2 分，2 cm<鈣化長度≤3 cm 計 3 分，>3 cm 計 4 分。雙側鈣化積分之和為最終得分，1～4 分為低鈣化，5～8 分為高鈣化［7］。根據頸動脈超聲檢查結果將其分為鈣化組（92例）和無鈣化組（40例），根據鈣化積分將鈣化組分為高鈣化組（58例）和低鈣化組（34例）。

1.4 臨床資料收集 收集各組臨床資料，包括年齡、性別、BMI、吸煙史、飲酒史、基礎疾病（高血壓、高脂血癥）、心腦血管疾病家族史、糖尿病病程、收縮壓、他汀類藥物使用情況及生化指標［TC、FPG、空腹胰島素（FINS）、胰島素抵抗指數（HOMA-IR）］。

1.5 統計學方法 采用SPSS25.0 統計軟件。計量資料用±s表示，比較采用單因素方差分析或獨立樣本t檢驗；Spearman 秩相關分析CML 與鈣化積分之間的相關性；Logistic 二元逐步回歸分析T2DM 患者頸動脈鈣化的危險因素；繪制受試者工作特征（ROC）曲線，用曲線下面積（AUC）評價CML 診斷T2DM 患者頸動脈鈣化的價值。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 鈣化組、無鈣化組、對照組臨床資料比較 鈣化組男 59 例、女33 例，年齡（63.75 ± 3.69）歲，BMI（26.13 ± 2.36）kg/m2，有吸煙史51 例、飲酒史38 例，伴高血壓53 例、高脂血癥62 例，心腦血管疾病家族史29例，T2DM病程（6.35±1.24）年，使用他汀類藥物 23 例；無鈣化組男 28 例、女 12 例，年齡（62.84 ±3.53）歲，BMI（23.21 ± 2.42）kg/m2，有吸煙史15 例、飲酒史12 例，伴高血壓15 例、高脂血癥19 例，心腦血管疾病家族史13例，T2DM病程（5.03±0.94）年，使用他汀類藥物17 例；對照組男29 例、女22 例，年齡（62.05 ± 3.42）歲，BMI（22.79 ± 2.15）kg/m2，有吸煙史18 例、飲酒史15 例，心腦血管疾病家族史19例。三組年齡、性別、飲酒史、心腦血管疾病家族史比較差異均無統計學意義（P均>0.05）。鈣化組BMI、有吸煙史比例、收縮壓、TC、FPG、FINS、HOMAIR、血清CML 水平高于無鈣化組、對照組（P均<0.05）。無鈣化組收縮壓、TC、FPG、HOMA-IR、FINS、CML 高于對照組（P均<0.05），BMI、有吸煙史比例與對照組比較差異均無統計學意義（P均>0.05）。鈣化組合并高血壓比例、合并高脂血癥比例、T2DM 病程高于無鈣化組，使用他汀類藥物比例低于無鈣化組（P均<0.05）。見表1。

表1 鈣化組、無鈣化組、對照組臨床資料比較（±s）

表1 鈣化組、無鈣化組、對照組臨床資料比較（±s）

注：與對照組比較，aP<0.05；與無鈣化組比較，bP<0.05。

組別鈣化組無鈣化組對照組F P n 92 40 51收縮壓（mmHg）138.45±6.35ab 130.82±4.19a 126.42±3.12 12.034<0.05 TC（mmol/L）5.72±0.42ab 5.07±0.29a 4.21±0.26 15.052<0.05 FPG（mmol/L）12.49±3.42ab 10.24±2.76a 4.05±0.28 26.351<0.05 FINS（mmol/L）10.49±3.05ab 8.36±2.41a 3.52±0.41 13.261<0.05 HOMA-IR 3.97±0.61ab 2.25±0.34a 1.05±0.26 15.261<0.05 CML（mg/L）76.49±19.35ab 52.31±16.11a 6.35± 2.01 21.351<0.05

2.2 高鈣化組與低鈣化組血清CML 水平比較 高鈣化組、低鈣化組血清CML 水平分別為（83.56 ±8.19）、（64.43 ± 6.35）mg/L，鈣化積分分別為（6.91± 1.05）、（2.61 ± 1.25）分。高鈣化組血清 CML 水平、鈣化積分高于低鈣化組（P<0.05）。Spearman 秩相關分析結果顯示，鈣化組血清CML 水平與鈣化積分呈正相關（rs=0.597，P<0.05）。

2.3 T2DM 患者頸動脈鈣化的影響因素 構建Lo?gistic 回歸方程，以T2DM 患者頸動脈鈣化為因變量（0=否、1=是），BMI（連續性變量）、吸煙史（賦值：0=否、1=是）、合并高血壓（賦值：0=否、1=是）、合并高脂血癥（賦值：0=否、1=是）、收縮壓、TC、FPG、FINS、HOMA-IR、T2DM 病程、使用他汀類藥物（賦值：1=是、2=否）、CML 為自變量，逐步法排除無關變量，最終高 TC、HOMA-IR、CML 是 T2DM 患者頸動脈鈣化的危險因素（P均<0.01），見表2。校正TC、HOMAIR 后CML 仍為T2DM 患者頸動脈鈣化的影響因素（OR=1.953，95%CI：1.842～2.632，P<0.05）。

2.4 血清CML診斷T2DM頸動脈鈣化的價值 ROC分析CML 診斷T2DM 頸動脈鈣化的最佳截斷值為73.49 mg/L，AUC為 0.717（95%CI：0.621～0.813，P<0.05），其靈敏度、特異度、約登指數、陽性預測值、陰性預測值、漏診率、誤診率、診斷符合率分別為78.26%、82.50%、0.61、91.14%、62.26%、21.74%、17.50%、79.55%。

3 討論

持續高糖環境下，蛋白質、脂類及核酸等經非酶糖基化，形成結構穩定的糖基化終產物（AGE）。AGE 通過過度氧化應激加速血管平滑肌細胞中的鈣沉積［8］。CML 是 AGE 最重要的活性成分之一，通過與細胞膜受體結合而影響巨噬細胞、血管內皮細胞、系膜細胞等功能釋放大量促炎因子，加重炎癥反應，并導致活性氧合成，誘導氧化應激反應，加重血管粥樣硬化進程。現有研究顯示，CML 通過干擾細胞內膽固醇反饋調節引起糖尿病腎病［9］，CML 升高與糖尿病患者血管并發癥發生有關［10］，血清CML 水平與糖尿病患者腦白質微結構改變和認知功能障礙發生有關［11］。本研究發現，T2DM 患者鈣化組CML水平高于無鈣化組和對照組，說明CML 在影像學發現血管鈣化之前已經出現異常升高，且CML 持續升高反映鈣化的發生。進一步觀察不同鈣化程度患者血清CML水平差異，發現高鈣化組血清CML水平高于低鈣化組，CML 與鈣化積分呈正相關，說明CML持續升高反映動脈鈣化的進展。李麗華等［12］發現，隨著糖尿病患者血清CML 水平升高脛前動脈斑塊內鈣化風險增加，與本研究結論一致。回歸分析結果顯示，高CML 水平是T2DM 患者發生頸動脈鈣化的危險因素之一，CML水平每增加1 mg/L，頸動脈鈣化風險將提高2.004 倍，校正TC、HOMA-IR 后CML仍與T2DM 患者頸動脈鈣化有關，進而證實了CML與T2DM 患者頸動脈鈣化的關系。CML 參與T2DM發生頸動脈鈣化的機制尚不清楚，可能為糖尿病早期已啟動蛋白質非酶糖化反應，誘導機體產生氧化應激，導致CML 產生增多，CML 能誘導單核巨噬細胞分泌生長促進因子，吞噬氧化低密度脂蛋白形成泡沫細胞，通過向內皮下遷移導致血管內皮細胞不斷增厚，導致動脈粥樣硬化斑塊形成［13］。丙酮酸脫氫酶激酶（PDK4）是細胞能量代謝中重要線粒體基質酶，在糖尿病、血管鈣化患者中均發現PDK4 過度激活。CML 通過介導活性氧表達，促使PDK4 激活，降低runt 相關轉錄因子2 表達，導致血管鈣化。在CML 誘導的血管鈣化過程中，可增加葡萄糖消耗，導致乳酸產生，改變血管平滑肌細胞葡萄糖代謝［8］。

表2 T2DM患者頸動脈鈣化影響因素的Logistic回歸分析

本研究 ROC 分析結果顯示，CML 診斷 T2DM 頸動脈鈣化的AUC 為0.717，靈敏度、特異度分別為78.26%、82.50%。提示 CML 可能成為T2DM 頸動脈鈣化診斷的新生物學指標，對于血清CML 水平明顯升高的T2DM 患者應高度警惕頸動脈鈣化的發生，預防心腦血管疾病。回歸分析結果顯示，除CML 外，高 TC、HOMA-IR 也是 T2DM 患者頸動脈鈣化的危險因素，胰島素抵抗導致血糖難以控制，長期處于高血糖環境下，血液黏滯度增加，血流速度減緩，糖類復合物沉積，致使血管平滑肌鈣化；其次高血糖會加重動脈壁AGE 堆積，誘導CML 水平升高，加速血管鈣化［14］。血脂代謝異常，血脂水平升高可引起脂質沉積于動脈管壁，引起血管壁增厚，管腔狹窄，血脂在血管壁沉積可破壞血管內皮細胞，釋放趨化、黏附分子，趨勢單核細胞遷移至內皮層形成巨噬細胞，巨噬細胞吞噬氧化低密度脂蛋白后形成泡沫細胞，形成動脈粥樣硬化斑塊［15］。提示對于T2DM患者應積極控制血糖，保持血糖穩定狀態，合并高脂血癥患者應增加他汀類藥物，降低血脂水平，以預防心腦血管疾病發生。

綜上所述，T2DM 患者血清CML 水平升高，高水平的CML可引起和加重動脈鈣化，監測CML水平可為T2DM 患者頸動脈鈣化評估提供參考。抑制AGE產生，尤其是CML 可能對逆轉頸動脈鈣化進程有益，為臨床治療提供新的靶點。