咳嗽變異性哮喘患兒外周血miR-155、SOCS-1表達變化與Th1/Th2失衡的關系

李雯，趙偉偉，葛建敏，吳俊峰，董建芳

張家口市第一醫院，河北張家口075000

咳嗽變異性哮喘（CVA）是一種以咳嗽為主的不典型哮喘，具有與典型哮喘類似的臨床和病理生理特征，如季節性咳嗽、氣道高反應性、嗜酸性氣道炎癥和氣道重塑等。CVA 是導致兒童慢性咳嗽的主要原因，部分患者可進展為典型哮喘［1］。CAV 存在輔助型T 細胞1（Th1）/輔助型T 細胞2（Th2）失衡，表現為以Th2 為主的免疫反應。Th2 相關細胞因子可誘導炎性介質釋放，導致局部氣道炎性細胞浸潤［2］。微小RNA 是一類小編碼RNA，在細胞增殖、炎性反應、免疫調節等病理生理過程中發揮重要作用［3］。微小RNA-155（miR-155）是一種多功能性非編碼蛋白RNA，其表達與癌癥發展、炎癥反應和免疫穩態有關，參與Th2 相關免疫應答［4］。細胞因子信號轉導蛋白抑制蛋白1（SOCS-1）是一種通過抑制Janus激酶（JAK）/轉錄信號轉導器和激活因子（STAT）來調控細胞因子信號轉導的調節因子，在免疫反應中發揮調控作用［5］。SOCS-1在活化單核細胞中異常表達，誘導M2 巨噬細胞分化，參與過敏性哮喘的發生發展［6］。因此，本研究擬探討 miR-155、SOCS-1 與CVA 患兒Th1/Th2 失衡的關系，以期為臨床CVA 治療提供理論基礎。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇 2018 年 3 月—2020 年 6 月本院收治的103 例CVA 患兒（CVA 組），納入標準：①具有典型CAV 癥狀，符合2013 版《中國兒童慢性咳嗽診斷與治療指南》中CAV診斷標準［7］；②病程大于1 個月；③肺功能正常。排除標準：①慢性阻塞性肺疾病、支氣管擴張、肺結核、肺部感染等疾病；②過敏性疾病、免疫性疾病、感染性疾病；③近1 個月服用免疫抑制劑；④合并惡性腫瘤。其中男59 例、女44例，年齡 2～12（7.25 ± 2.16）歲，有哮喘家族史 42例，過敏體質21 例，IgE 陽性53 例。另選擇同期本院兒科保健門診接診的72例健康兒童為對照組，均經門診體檢排除呼吸道感染、哮喘、高血壓、糖尿病、免疫性疾病等。其中男39 例、女33 例，年齡2～11（7.93 ± 2.04）歲。兩組性別、年齡比較差異無統計學意義（P均>0.05）。受試兒童法定監護人均簽署知情同意書。本研究獲得醫院醫學倫理委員會批準。

1.2 外周血miR-155、SOCS-1 mRNA 表達檢測 采用RT-PCR 法。采集兩組空腹靜脈血5 mL，注入EDTA 抗凝管，4 ℃ 3 000 r/min 離心 20 min（離心半徑10 cm），分離血漿，-80 ℃保存備用。室溫復融血漿樣本，采用TRIzol 試劑（美國Ambio 公司）提取總RNA，采用 CFX96 實時熒光PCR 儀（美國Bio-Rad 公司）M-MLV 逆轉錄酶（Epicentre 公司）進行RT-PCR，將總RNA轉錄為cDNA。反轉錄體系共18 μL，包括RNA 模板 5 μL，OligodT 1 μL，反轉錄酶（50 U/μL）1 μL，RNA 酶 抑 制劑（20 U/μL）0.5 μL，dNTPs（100 mmol/L）1 μL，Buffer 液1.5 μL，DEPC 水5 μL，U6及miRNA引物3 μL。引物合成及序列測定由上海基康公司完成。miR-155 上游引物5'-CGTTAATGC?TAATCGTGATAG-3'，下 游 引 物 5'-GCAGGGTCC?GAGGT-3'；SOCS-1 上 游 引 物 5'-AGACCCCTTCT?CACCTCTTG-3'， 下 游 引 物 5'-CTGCACAG?CAGAAAAATAAAGC-3'；U6上游引物5'-CTCGCTTC?GGCAGCACA-3'，下 游 引 物 5'-AACGCTTCAC?GAATTTGCGT-3'。反應條件：95 ℃預變性10 s，65 ℃變性 20 s；75 ℃退火15 s，共40 個循環。擴增條件：95 ℃預變性 10 min，95 ℃變性 15 s、60 ℃退火 60 s，45 個循環，共進行 3 次平行試驗。用 2-ΔΔCt法計算miR-155、SOCS-1 mRNA相對表達量。

1.3 外周血Th1、Th2 及其相關細胞因子檢測 采集兩組肘靜脈血6 mL，一份注入EDTA 抗凝管混勻檢測Th1、Th2，一份注入干燥試管檢測相關細胞因子。取100 μL 血液標本注入流式檢測管，加入Per?CP-小鼠抗人CD4 單克隆抗體IgG，室溫避光孵育30 min，加入 2 mL 紅細胞 lysis Buffer 混勻，室溫避光孵育10 min，300 g 離心5 cm（離心半徑10 cm）棄上清，用2 mL 磷酸鹽緩沖液洗滌。加入PerCP-抗CD3和PE-抗CD8抗體，再次離心洗滌，加入500 μL磷酸鹽緩沖液重懸細胞，制成外周血單個核細胞液懸液（1×104/mL）。用 EPICS-XL 流式細胞儀檢測 Th1、Th2 細胞比例，計算Th1/Th2。干燥試管血標本置于安徽中科中佳臺式離心機KDC-1044L 進行離心處理，離心半徑為15 cm，離心速率3 000 r/min，離心時間為10 min，取血清-80 ℃保存。采用酶鏈免疫吸附試驗檢測Th1 細胞分泌的干擾素（IFN-γ）、白細胞介素2（IL-2）及Th2 細胞分泌的IL-4、IL-10。試劑盒購自上海透景生命科技股份有限公司。

1.4 統計學方法 采用SPSS25.0 統計軟件。計量資料用±s表示，比較采用獨立樣本t檢驗。各指標之間的相關性分析采用Pearson 相關。P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組外周血miR-155、SOCS-1 mRNA 表達比較 CVA 組外周血 miR-155、SOCS-1 mRNA 相對表達量高于對照組（P均<0.05），見表1。

表1 兩組miR-155、SOCS-1 mRNA表達比較（±s）

表1 兩組miR-155、SOCS-1 mRNA表達比較（±s）

組別CVA組對照組t P n 103 72 miR-155 1.32±0.42 0.39±0.05 22.697<0.05 SOCS-1 mRNA 1.21±0.32 0.25±0.06 29.486<0.05

2.2 兩組 Th1、Th2、Th1/Th2 及其相關細胞因子比較 CVA 組 Th2 比例及 IL-4、IL-10 水平高于對照組（P均<0.05），Th1 比例、Th1/Th2 及 INF-γ、IL-2 水平低于對照組（P均<0.05），見表2、3。

表2 兩組Th1、Th2及Th1/Th2比較（±s）

表2 兩組Th1、Th2及Th1/Th2比較（±s）

組別CVA組對照組t P n 103 72 Th1（%）3.62±0.72 6.42±2.13 12.453<0.05 Th2（%）3.31±2.09 1.39±0.42 13.697<0.05 Th1/Th2 1.09±0.27 4.76±1.51 23.925<0.05

表3 兩組相關細胞因子水平比較（pg/mL，±s）

表3 兩組相關細胞因子水平比較（pg/mL，±s）

組別CVA組對照組t P n 103 72 INF-γ 46.35± 9.59 62.35±15.49 8.782<0.05 IL-2 32.15± 6.28 52.35±13.49 13.575<0.05 IL-4 46.35±9.35 20.21±3.56 5.997<0.05 IL-10 26.35±5.15 13.43±4.23 19.386<0.05

2.3 CVA 組外周血 miR-155、SOCS-1 mRNA 表達與Th1、Th2、Th1/Th2 及相關細胞因子的相關性 CVA組患者外周血miR-155 表達與SOCS-1 mRNA 表達呈 正相 關（r=0.612，P<0.05）。CVA 組 外 周 血miR-155、SOCS-1 mRNA表達與Th2比例、IL-4、IL-10呈正相關（P均<0.05），與Th1比例、Th1/Th2、INF-γ、IL-2均呈負相關（P均<0.05）。見表4。

3 討論

CVA 是典型哮喘的前驅癥狀，患兒臨床僅表現為咳嗽，無喘息或呼吸短促，肺功能正常，但是CVA患兒可出現呼吸道嗜酸性粒細胞為主的炎性細胞浸潤、平滑肌痙攣、氣道高反應性和呼吸道重構［7］。CVA 患兒對抗生素治療無反應，但傳統哮喘治療有效，被認為是特殊表型的哮喘，30%～40%的CVA 可發展成為典型哮喘，嚴重影響肺功能［8-9］。哮喘患者存在顯著的Th1/Th2 失衡，Th2 亞群占優勢易引起IgE 血癥、嗜酸性粒細胞增多癥，在哮喘發病過程中發揮關鍵作用［10-11］。CVA 與典型哮喘發病機制大致相同，Th1/Th2失衡引起的Th2優勢應答可能是其重要的免疫學發病機制［12］。

表4 CVA組外周血miR-155、SOCS-1與Th1、Th2、Th1/Th2及相關細胞因子的相關性

Th1、Th2 細胞分化和平衡調節通過細胞內轉錄、信號途徑實現。miRNA 在免疫細胞發育分化中起調控作用，其異常表達可能導致免疫紊亂［13］。miR-155來源于B細胞整合簇，在人胸腺、脾臟、肺等富含免疫細胞器官中高表達，在Th 細胞分化、細胞因子生成、免疫監管中發揮重要作用［14］。miR-155與免疫系統疾病發病密切相關。現有研究顯示，miR-155 在免疫性血小板減少癥患者中表達上調，與 B 淋巴細胞功能相關［15］，miR-155 在過敏性紫癜患者表達升高，參與調節過敏性氣道炎癥反應以及IL-33信號傳導［16］。miR-155與哮喘的發生也有著密切的關系，在介導T 細胞過敏性炎癥反應中發揮作用［17］。本研究發現，miR-155 在 CVA 患兒中表達增高，且 miR-155 表達與 Th2 比例、IL-4、IL-10 呈正相關，與Th1、Th1/Th2、INF-γ、IL-2 呈負相關，說明Th1/Th2 與CVA 患兒Th1/Th2 失衡有關。相關報道指出miR-155參與T細胞免疫反應和相關細胞功能，過表達 miR-155 可促進 IFN-γ 誘導的 Th1 細胞分化，促進IL-4 誘導的 Th2 表型，miR-155 缺失是導致 Th2 活化受損的主要原因［4］。轉移相關肺腺癌轉錄本1（MALAT1）可抑制CD4+T 細胞中miR-155 表達，細胞毒 T 淋巴細胞相關抗原 4（CTLA-4）是 MALAT1 上游調節因子，CTLA-4/MALAT1/ miR-155 軸參與Th1/Th2平衡調節［18］。以上結果提示，miR-155是CVA患兒Th2相關變態反應性疾病的關鍵介質。

SOCS-1是細胞因子信號轉導的負性調節因子，經 IL-6 刺激 M1細胞后誘導 STAT3 活化，SOCS-1 通過與JAK 催化域JH1 區絡氨酸殘基結合反饋性調控 JAK/STAT 信號通路，影響細胞增殖分化［19］。SOCS-1 還可通過toll 樣受體（TLR）促效劑阻斷TLR信號轉導，參與多種免疫反應調控［20］。現有報道顯示SOCS-1 參與兒童過敏性紫癜T 輔助17 細胞/調節性T 細胞失衡調節過程［21］，與哮喘發病也密切相關［22］。本研究發現，SOCS-1 在 CVA 患兒中表達升高，且其表達與Th1/Th2失衡有關，說明SOCS-1參與了Th1/Th2 的調控過程。機體在抗原刺激下JAK/STAT信號通路活化，促使SOCS-1表達，SOCS-1負向調控細胞因子信號轉導，調控Th1/Th2 處于動態平衡中，維持機體免疫穩態，SOCS-1 調控異常可引起Th1/Th2 失衡［23］。SOCS-1 參與 CVA 患兒 Th1/Th2 失衡的機制可能為：CVA 局部氣道炎癥反應誘導IL-6分泌增加，IL-6 通過 JAK/STAT 途徑誘導 SOCS-1 表達抑制Th1相關細胞因子IFN-γ分泌；另一方面通過Ras 蛋白/細胞外信號調節激酶/絲裂原活化蛋白激酶途徑活化T 細胞核因子2，促使IL-4 介導的Th2 細胞分化。說明SOCS-1 可干擾IFN-γ 信號途徑抑制Th1 分化，激活IL-4 信號途徑促使Th2 細胞優勢活化，導致Th1/Th2失衡［24］。

本研究中miR-155 與SOCS-1 表達呈正相關，說明 miR-155、SOCS-1 在 CVA 患兒 Th1/Th2 失衡中發揮作用。研究顯示，SOCS-1 是miR-155 的靶點，miR-155可調控SOCS-1表達，二者參與小膠質細胞炎癥反應、氧化應激和免疫反應［25］。miR-155/SOCS-1軸在登革病毒感染介導的宿主免疫反應中發揮重要作用［26］。以上結果提示，miR-155/SOCS-1 軸參與CVA患兒Th1/Th2失衡過程。miR-155、SOCS-1可直接調控T 淋巴細胞分化，也可通過miR-155/SOCS-1軸抑制Th1 細胞分化，促使Th2 優勢反應，進而誘導CVA發生和進展。

綜上所述，CVA 患兒外周血miR-155、SOCS-1呈高表達，miR-155、SOCS-1 可能參與了 CVA 患兒Th1/Th2 失衡過程。由于Th1/Th2 調控機制復雜，miR-155、SOCS-1 在 CVA 患兒 Th1/Th2 失衡中的調控機制尚待更多基礎研究和體外研究證實。