結核分枝桿菌對miR-21和TLR-4/NF-κB信號通路的影響研究*

麥 葉，林瑤瑤，劉海林，鐘有清

(1.海南省中醫院重癥醫學科，海口 570203；2.海南醫學院第一附屬醫院呼吸內科，海口 570102)

肺結核是1種主要由結核分枝桿菌(Mtb)感染引起的慢性消耗性傳染病，在經濟欠發達國家和地區，其近年來發病率不斷升高，嚴重威脅人類健康[1]。巨噬細胞可吞噬入侵的Mtb，并呈遞抗原，使機體獲得特異的抗結核免疫力，但Mtb是典型的細胞內寄生菌，可通過多種機制逃避巨噬細胞的抗微生物作用，在巨噬細胞等宿主免疫細胞內存活和繁殖。研究顯示，機體的免疫應答反應抑制Mtb生長，其中90%的病原體潛伏在感染病灶中，進入休眠狀態。一旦免疫系統出現異常，休眠狀態的Mtb即進入復蘇狀態，肺結核復發[2]。在肺結核致病及復發過程中，Mtb與巨噬細胞的相互影響發揮重要作用[3]。因此，研究其作用機制對于探討肺結核的臨床治療具有重要意義。Toll樣受體(TLR)是人呼吸道天然免疫中的關鍵受體，TLR4廣泛表達于氣道上皮，在呼吸道黏膜免疫中有重要作用，可能參與肺結核發生、發展[4]。有研究報道，微小RNA(miRNA/miR)可調節TLR信號通路[5]。本研究將Mtb感染RAW264.7和THP-1細胞后，對miR-21表達和TLR-4/核因子-κB(NF-κB)信號通路的影響進行分析，旨在研究Mtb與巨噬細胞的相互作用機制，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌株與細胞株

RAW264.7和THP-1細胞購自中科院上海細胞庫；強毒Mtb H37Rv及弱毒Mtb BCG(牛型結核桿菌減毒株，卡介苗)購自北京生物制品研究所。

1.1.2主要試劑與材料

DMEM培養基、1640培養液、二甲基亞砜(DMSO)購自美國Sigma公司；胎牛血清購自美國Hyclone公司；Trizol試劑、逆轉錄試劑盒、實時熒光定量PCR(qRT-PCR)試劑盒購自美國R&D公司；流式細胞儀、異硫氰酸熒光素(FITC)-膜聯蛋白V(Annexin V)-碘化丙啶(PI)凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司；蛋白提取試劑盒購自上海碧云天生物公司；本研究所使用ELISA試劑盒均購自南京森貝伽生物科技有限公司；miR-21與內參基因U6基因及TLR4、NF-κB和內參基因β-actin引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1細胞及Mtb培養

RAW264.7細胞：復蘇后常規培養于含有10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM培養基內(5% CO2，37 ℃飽和濕度)，置于細胞培養箱培養，0.1%胰蛋白酶消化懸浮，鋪于12孔板中繼續培養(5×105個/mL)。THP-1細胞:復蘇后常規培養于含有10%胎牛血清、1%雙抗的RPMI 1640培養液內(5% CO2，37 ℃飽和濕度)，置于細胞培養箱培養，調整濃度為5×105個/mL，利用佛波醇酯類多克隆刺激(PMA)誘導24 h，待細胞分化貼壁后，在12孔板中繼續培養。Mtb：將羅氏培養基上的H37Rv菌落分別刮下，接種于7H9液體培養基培養5 d，液體可見明顯渾濁，且有白色顆粒，菌膜掛壁；BCG菌株接種于7H9液體培養基培養7 d，可見液體稍許渾濁，且有黃色顆粒，菌膜掛壁。

1.2.2Mtb感染RAW264.7細胞和THP-1細胞模型建立

細胞濃度為5×105個/mL，Mtb濃度5×106個/mL，使Mtb感染12孔板中貼壁良好的細胞，5% CO2，37 ℃細胞培養箱中孵育4 h(培養基中無血清和雙抗)，繼續培養48 h。實驗分組：RAW264.7細胞分為對照組、H37Rv感染組和BCG感染組；THP-1細胞分為對照組、H37Rv感染組和BCG感染組。

1.2.3細胞凋亡檢測

胰蛋白酶消化感染后細胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸，洗滌后，利用平板計數，使細胞數為1×105個/mL，加入Annexin V-FITC及PI溶液，避光孵育(25 ℃，15 min)，加入Buffer，利用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。細胞凋亡率=(凋亡細胞數/總細胞數)×100%。

1.2.4qRT-PCR檢測miR-21、TLR4、NF-κB mRNA表達

利用Trizol法提取總RNA，檢測合格后，利用逆轉錄試劑盒逆轉錄，獲得cDNA,利用qRT-PCR試劑盒檢測miR-21、TLR4、NF-κB mRNA表達。反應體系為20 μL：2×SYBR Green Mix 10 μL，正向引物1 μL，反向引物1 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 7 μL。反應條件如下：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個循環，循環結束后升溫至95 ℃ 15 s，降至60 ℃ 15 s，95 ℃ 20 min。每個標本均重復檢測3次，結果取平均值，相對表達水平根據2-ΔΔCT法計算，見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.5細胞因子檢測

利用ELISA法檢測感染12 h后[6]細胞上清液中白細胞介素(IL)-6、IL-10、腫瘤壞死因子(TNF)-α表達水平。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 RAW264.7和THP-1細胞形態變化

RAW264.7正常細胞折光度好，邊緣清晰，感染后細胞發生皺縮，細胞質內有小泡，邊界不清晰；正常THP-1細胞大小均一，細胞透亮，形態規則，包膜完整，PMA誘導后貼壁生長，部分細胞伸出偽足，見圖1。

A：正常RAW264.7細胞；B：Mtb感染后RAW264.7細胞；C：正常THP-1細胞；D：PMA誘導后THP-1細胞。

2.2 細胞凋亡檢測結果

在THP-1細胞中，H37Rv感染組及BCG感染組細胞凋亡率較對照組明顯升高，且BCG感染組細胞凋亡率較H37Rv感染組明顯升高(P<0.05)。在RAW264.7細胞中，H37Rv感染組及BCG感染組細胞凋亡率較對照組明顯升高，且BCG感染組細胞凋亡率較H37Rv感染組明顯降低(P<0.05)，見圖2。

A：RAW264.7細胞對照組；B：RAW264.7細胞BCG感染組；C：RAW264.7細胞H37Rv感染組；D：THP-1細胞對照組；E：THP-1細胞BCG感染組；F：THP-1細胞H37Rv感染組；G：細胞凋亡比例；a：P<0.05，與對照組比較；b：P<0.05，與H37RV感染組比較。

2.3 miR-21、TLR4、NF-κB mRNA表達情況

與RAW264.7細胞對照組比較，BCG感染組及H37Rv感染組miR-21低表達，TLR4、NF-κB mRNA高表達(P<0.05)，且BCG感染組TLR4、NF-κB mRNA較H37RV感染組表達水平更高(P<0.05)。與THP-1細胞對照組比較，BCG感染組及H37Rv感染組miR-21低表達，TLR4、NF-κB mRNA高表達(P<0.05)，且BCG感染組TLR4、NF-κB mRNA較H37Rv感染組表達水平更高(P<0.05)，見圖3。

A：RAW264.7細胞mRNA表達情況；B：THP-1細胞mRNA表達情況；a：P<0.05，與對照組比較；b：P<0.05，與H37Rv感染組比較。

2.4 細胞因子檢測結果

與RAW264.7細胞對照組比較，BCG感染組及H37Rv感染組TNF-α、IL-6、IL-10表達水平均明顯升高(P<0.05)，且BCG感染組TNF-α、IL-6表達水平較H37Rv感染組明顯降低，IL-10明顯升高(P<0.05)。與THP-1細胞對照組比較，BCG感染組及H37Rv感染組TNF-α、IL-6、IL-10表達水平明顯升高(P<0.05)，且BCG感染組TNF-α、IL-6表達水平較H37RV感染組明顯升高，IL-10明顯降低(P<0.05)，見圖4。

A：細胞TNF-α表達水平；B：細胞IL-6表達水平；圖C：細胞IL-10表達水平；*：P<0.05，與對照組比較；#：P<0.05，與H37Rv感染組比較。

3 討 論

作為一種人畜共患的消耗性疾病，肺結核嚴重危害我國民眾的生命健康。近年來，由于部分耐藥Mtb的出現，結核病的防治工作面臨新的威脅。目前，多項研究結果顯示，巨噬細胞是宿主控制Mtb感染散播的主要防御屏障，可吞噬Mtb，進行消化清除[7-8]。另外，巨噬細胞在Mtb免疫逃逸中也發揮重要作用，導致結核病的慢性癥狀，使其具有潛伏性和傳染性。靜息狀態的巨噬細胞被抗原刺激活化，產生多種細胞因子繼續刺激、活化巨噬細胞，吞噬Mtb，誘導巨噬細胞壞死，引起巨噬細胞崩解，將Mtb釋放，重新被其他巨噬細胞吞噬，使Mtb得以在細胞間傳播。感染后的巨噬細胞發生凋亡，分解為有囊膜包裹的吞噬小體，吞噬小體可降低Mtb活性，促進機體先天性免疫反應。RAW264.7細胞及可經PMA誘導分化為巨噬細胞的THP-1細胞已被廣泛應用于Mtb與巨噬細胞相互作用的研究中[9]。本研究通過構建Mtb感染巨噬細胞模型，檢測發現，與對照組比較，RAW264.7、THP-1細胞H37Rv感染組及BCG感染組凋亡率均明顯升高，與H37Rv感染組比較，THP-1細胞BCG感染組凋亡率明顯升高，RAW264.7細胞明顯降低，提示Mtb感染巨噬細胞可誘導其凋亡，與呂翎娜等[9]研究結果一致。

有研究顯示，TLRs信號在機體適應性免疫應答及固有性免疫應答中具有重要作用，與多種疾病發生、發展關系密切[10]。TLR4主要表達于巨噬細胞，可識別病原相關分子，通過胞內信號傳遞，誘導免疫炎性因子，擴大非特異性防御作用。TLR4介導的信號轉導通路包括MyD88依賴性和非依賴型兩條，TLR4活化后，可與MyD88羧基端TLR受體結構域結合，通過一系列磷酸化反應，活化NF-κB誘導激酶(NIK)，NIK可使NF-κB抑制蛋白泛素化降解，從而激活NF-κB，活化后的NF-κB由細胞質進入細胞核內，啟動細胞因子的轉錄、翻譯，最終促進TNF-α、IL-6、IL-10的分泌。有研究顯示，細菌脂多糖可活化單核巨噬細胞表面TLR4，繼而激活NF-κB，誘導炎性因子IL-6、TNF-α釋放，參與固有免疫應答[11]。Mtb細胞壁含有大量的分枝菌酸、脂類和多糖，可通過識別、激活巨噬細胞表面的多種受體，如TLR4等，啟動相應的免疫防御反應。大量研究表明，miR-21在呼吸道相關疾病中異常表達[12-13]。生物信息學顯示，miR-21可能通過靶向調節TLR-4參與機體免疫反應。許瑞等[14]研究報道，高表達miR-21可增加下調TLR4基因的活化能力，引起通路下游NF-κB及IL-6活性降低。同時，也有研究證明，IL-6、IL-10、TNF-α等細胞因子可通過細胞外正反饋調節，進一步導致NF-κB活化[15]。本研究結果顯示，感染后RAW264.7及THP-1細胞miR-21低表達，TLR4、NF-κB mRNA高表達，且BCG感染組較H37Rv感染組miR-21低表達，TLR4、NF-κB mRNA高表達，提示Mtb感染可能抑制巨噬細胞內miR-21表達，進而促進TLR4、NF-κB mRNA表達。進一步檢測發現，感染12 h后的RAW264.7及THP-1細胞TNF-α、IL-6、IL-10表達水平均明顯升高；在RAW264.7細胞中，BCG感染組較H37Rv組TNF-α、IL-6表達水平明顯降低，IL-10明顯升高；在THP-1細胞中，BCG感染組較H37Rv組TNF-α表達水平明顯升高，IL-6、IL-10表達水平明顯降低，提示Mtb感染可能影響巨噬細胞的細胞因子分泌。

綜上所述，Mtb感染促進巨噬細胞凋亡，抑制機體miR-21表達，從而激活TLR-4/NF-κB信號通路。本研究選擇不同毒性的Mtb感染兩種巨噬細胞，結果表明，兩種Mtb對信號通路及細胞的因子的影響有一定差異，具體原因及機制將在后續研究中展示。